摘要：为研究结核杆菌毒力因子cfp10在结核杆菌感染细胞过程中的功能,本研究根据GenBank中登录的结核杆菌H37Rv的cfp10基因序列设计1对引物,以结核杆菌H37Rv基因组DNA为模板,PCR扩增得到cfp10基因DNA片段。将扩增片段克隆于pGM18-T载体中,测序验证后,再将cfp10基因亚克隆至pEGFP-N1中,经核苷酸序列测定和酶切鉴定获得重组表达质粒pEGFP-N1-cfp10,分别转染293T细胞和U937细胞。经western blot分析表明cfp10-EGFP融合蛋白在293T细胞和U937细胞中均获得了表达。通过激光共聚焦显微镜观察显示在293T细胞和U937细胞,cfp10-EGFP融合蛋白主要分布于细胞质。本研究为进一步研究毒力因子cfp10在感染宿主细胞中的作用奠定了基础。

摘要：目的克隆表达结核分枝杆菌cfp10-ESAT6-Rv3425基因片段融合蛋白并纯化,测抗原的免疫原性,为结核病的临床诊断提供有效的候选抗原。方法利用生物信息学分析免疫优势位点,设计不同引物,采用聚合酶链反应(PolymeraseChain Reaction,PCR)扩增出相应基因片段,插入pET30a表达载体,转入大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达目的蛋白,亲和纯化后用H37Rv免疫的兔血清进行间接酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)测定其免疫原性。结果 PCR扩增的cfp10、ESAT6和Rv33425基因片段与基因文库(Genbank)报道的完全一致。三者在大肠杆菌BL21(DE3)中融合表达的产物约为22kDa,与预计大小相吻合。Ni-NTA亲和纯化出目的蛋白。ELISA显示该蛋白具有较强的免疫原性。结论结核分枝杆菌cfp10-ESAT6-Rv3425融合基因片段的融合表达纯化后,可作为结核病免疫诊断的一个候选抗原。

摘要：目的:构建结核分枝杆菌分泌蛋白的重组质粒及工程菌,获得纯化的cfp10-ESAT6P蛋白抗原,制备初步用于检测结核病患者的特异性抗体。方法:根据编码结核分枝杆菌基因序列设计引物,克隆表达结核cfp10-ESAT6重组蛋白,表达产物免疫新西兰大白兔,其中80%可产生高价的抗体。利用产物建立IgG间接ELISA方法鉴定其抗原性及实用性。结果:应用ELISA法,通过检测113例结核病患者、82例非结核病患者及健康献血员,cfp10-ESAT6P和对照PPD对结核病患者血清检测的敏感性分别为89.4%和79.6%,特异性分别为96.3%和93.9%。结论:高效表达纯化的cfp10-ESAT6蛋白抗原性强,可用于结核病患者抗体的检测,用于结核病的辅助诊断。

摘要：为了研究结核杆菌毒力因子ESAT6在结核杆菌感染细胞过程中的功能。采用分子生物学方法,根据Gen-Bank中登录的结核杆菌H37Rv的ESAT6基因序列设计1对引物,以结核杆菌H37Rv基因组DNA为模板,PCR扩增得到ESAT6基因DNA片段。将扩增片段克隆于pGM18-T载体中,测序验证后,再将ESAT6基因亚克隆至pEGFP-N1中,经核苷酸序列测定和酶切鉴定获得重组表达质粒pEGFP-N1-ESAT6。用重组表达质粒pEGFP-N1-ESAT6转染293T细胞。结果显示:重组表达质粒pEGFP-N1-ESAT6测序结果正确,转染细胞后出现绿色荧光,经Western blot分析鉴定,可见约35kDa的预期蛋白条带,证实ESAT6-EGFP融合蛋白在293T细胞中获得了表达。研究结果为进一步研究毒力因子ESAT6在感染宿主细胞中所发挥胞内生存机制奠定了基础。