摘要：crispr-cas12a是一种功能强大且可编程的分子诊断技术。本文基于crispr-cas12a的附属切割活性与G-四链体/氯化血红素(Hemin)复合物,设计了一个免标记电化学生物传感器,实现对miRNA的强特异性检测。靶标miRNA-21与双链DNA探针上的Toehold区域结合并发生链置换反应,置换出双链DNA探针中较短的DNA。置换下来的DNA可以有效地激活crispr-cas12a的附属切割活性。随后,具有附属切割活性的cas12a切割电极表面上形成G-四链体/Hemin的DNA序列,导致电流信号减弱。在最优条件下,电流信号强度变化与10~100 pmol/L范围内的miRNA-21浓度呈良好的线性关系,检出限为4.2 pmol/L。该电化学生物传感器能够实现对单个碱基突变的miRNA-21或其它miRNA序列特异性识别,并可用于人血清样本(10%)中miRNA-21的检测。

摘要：为提高牛奶中大肠杆菌的检测效率,简化分析流程,该文建立基于成簇的规则间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,crispr)的牛奶中大肠杆菌快速检测体系。首先,构建crispr相关蛋白(crispr-associated protein,crispr-cas),crispr-cas12a的重组表达质粒,并将其转化至BL21感受态细胞,利用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(lsopropyl β-D-thiogalactoside,IPTG)诱导表达cas12a蛋白。然后,通过麦芽糖结合蛋白(maltose binding protein,MBP)亲和层析、凝胶过滤层析等方法将cas12a蛋白进行纯化。最后,设计靶向大肠杆菌16S rDNA目的片段的特异性crispr RNA (crRNA),将特异性的crRNA、大肠杆菌16S rDNA的聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)胶纯化产物和纯化的cas12a蛋白进行混合,建立crispr-cas12a靶向切割体系。验证结果显示该体系可用于检测牛奶样品中的大肠杆菌。

摘要：目的建立一种基于重组酶聚合酶扩增(recombinase-aided amplification,RAA)和crispr-cas12a系统的荧光快速检测恶性疟原虫方法,并对其检测效能进行初步评价。方法选择恶性疟原虫18S核糖体RNA(rRNA)基因为靶序列,设计和合成3组RAA引物及crispr来源RNA(crRNA),选择最佳组合并优化反应条件,建立荧光RAA/crisprcas12a检测方法。构建包括靶标区的恶性疟原虫3D7株18S rRNA基因质粒,将质粒浓度分别稀释成1000、100、10、1拷贝数/μL进行荧光RAA/crispr-cas12a反应,评价荧光RAA/crispr-cas12a法检测敏感度;分别以间日疟原虫、三日疟原虫、卵形疟原虫、乙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒、梅毒螺旋体基因组DNA为模板,进行荧光RAA/crispr-cas12a反应,评价荧光RAA/crispr-cas12a法检测特异度。分别采用荧光RAA/crispr-cas12a法和巢式PCR法对50份疟疾临床样本进行检测,比较两种方法检测一致性。体外培养恶性疟原虫3D7株,经培养后获得的培养物采用健康人O型红细胞悬液稀释成1000、500、200、50、10个/μL等不同虫密度血液样本,以荧光RAA/crispr-cas12a法进行检测,评价检测效果。结果选择Pf-F3/Pf-R3/crRNA2作为引物组合、2.5μL作为B buffer添加量、40 min作为RAA反应时间和37℃作为crispr-cas12a反应温度建立荧光RAA/crispr-cas12a法,其可检出浓度为1拷贝数/μL的含恶性疟原虫3D7株18S rRNA基因的质粒;该法检测恶性疟原虫可见荧光信号,但检测卵形疟原虫、三日疟原虫、间日疟原虫及阴性对照均无荧光信号,且与梅毒螺旋体、人类免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒等其他病原体亦无交叉反应。采用荧光RAA/crisprcas12a法和巢式PCR法分别检测50份疟疾临床样本,两种方法检测结果完全一致(kappa值=1.0,P<0.001)。恶性疟原虫3D7株经6d体外培养,获得10 mL培养物,采用荧光RAA/crispr-cas12a法检测稀释后的临床样本,得到最低检测限为50个疟原虫/μL。结论荧光RAA/crispr-cas12a法检测恶性疟原虫快速、敏感、特异,有望用于恶性疟原虫快速检测和风险监测。

摘要：向日葵黑茎病菌是向日葵上的一种毁灭性真菌,是我国的植物检疫性有害生物。为了准确快速检测向日葵黑茎病菌,本研究根据向日葵黑茎病菌及其近似种的ITS序列差异,设计特异性RPA引物和crispr-cas12a crRNA,建立了RPA等温扩增技术结合crispr-cas12a检测的快速检测方法。通过条件优化,RPA/crispr-cas12a检测体系在37℃恒温条件下,RPA反应30 min,crispr/cas12a反应20 min,即可特异性检测向日葵黑茎病菌。荧光法检测灵敏度与实时荧光PCR的灵敏度相当,最低检测量为0.1 pg,试纸条法检测最低检测量为1 pg。由于试纸条检测结果可用肉眼观察,快速便携,操作简单,更适合用于田间和口岸的向日葵黑茎病菌快速早期检测;而荧光检测灵敏度高,对环境要求高,更适合用于实验室检测。

摘要：【背景】十足目虹彩病毒1 (Decapod Iridescent Virus 1,DIV1)可感染南美白对虾、中国对虾和日本对虾等,是危害对虾养殖业的主要病毒之一。当前高效、快速、简便地检测对虾是否感染DIV1是减少其发生和危害的重要途径。【目的】将成簇的规律间隔短回文重复序列(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats,crispr)及其相关蛋白12a (crispr Associated Protein 12a,cas12a),即crispr-cas12a系统,与重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification,RPA)技术相结合,建立快速检测DIV1的方法(RPA-cas12a),并探讨该方法在实际样本检验中的应用价值。【方法】通过提取DIV1DNA,设计其RPA引物、crRNA及报告探针,优化并建立RPA结合crispr-cas12a的快速检测方法,进一步分析该方法检测DIV1的灵敏度与特异性,并比较建立的方法与qPCR法的一致性。【结果】建立的RPA-cas12a快速检测方法可在40min内实现对虾样本DNA中DIV1的检测,检测限为10 copies/reaction。用该方法分别对对虾白斑综合征病毒(White Spot Syndrome Virus,WSSV)、传染性皮下及造血组织坏死病毒(Infectious Hypodermal and Hematopoietic Necrosis Virus,IHHNV)、虾肝肠胞虫(Enterocytozoon Hepatopenaei,EHP)及DIV1进行检测,结果仅DIV1发生特异性反应,而WSSV、IHHNV和EHP的检测结果均为阴性。采用RPA-cas12a检测61份实际样本,结果均与qPCR检测法的阳性检出率一致。【结论】建立的RPA-cas12a方法检测十足目虹彩病毒1具有快速、简便、灵敏度高且特异性强的特点,为十足目虹彩病毒1的快速检测提供了新的工具。

摘要：目的:通过构建快速、灵敏的凝血酶检测技术,为多种血管栓塞性疾病,如脑静脉窦血栓形成(cerebral venous sinus thrombosis,CVST)的早期诊断和治疗提供新的策略。方法:利用所筛选的高特异性凝血酶适配体设计发夹结构变构探针,用于高特异性识别凝血酶并将凝血酶信号转化为核酸信号。在变构探针识别凝血酶后,适配体结合凝血酶引发变构探针变构,暴露cas12a活性部分。crispr-cas12a系统识别活性部分后,其反式切割特性被触发,开始无序切割周围存在的单链DNA荧光探针,导致标记在荧光探针两端的荧光基团(Cy3)和淬灭基团(BHQ)分离,使处于被淬灭状态的Cy3荧光重新出现。所产生的荧光信号的强度与体系中存在的凝血酶浓度呈正相关。结果:通过荧光实验证实所设计的变构探针对凝血酶表现出极高的识别特异性和稳定性;在所优化的实验条件下,该方法表现出良好的检测性能,检测限为0.23 pmol/L。结论:该方法结合了高灵敏度、低成本和良好的便携性等优点,为凝血酶相关疾病的检测与精准诊断提供了强有力的技术支持。

摘要：为建立可用于临床检测猪胸膜肺炎放线杆菌(App)的方法,本研究根据App apxIVA基因3’末端保守区,设计crispr/cas12a特异性gRNA,在gRNA序列与靶序列结合位点的上下游区域内,利用Primer Premier 5.0设计重组酶聚合酶扩增(RPA)引物,利用RPA引物扩增靶基因apxIVA,通过gRNA识别特异性靶基因序列,激活cas12a蛋白单链DNA酶的切割活性,根据免疫层析试纸条检测原理设计单链DNA报告分子,使用免疫层析试纸条检测体系内报告分子是否被切割进而实现对靶基因的检测。并通过各反应条件的优化建立了一种针对APP的检测方法。反应条件优化结果显示,最佳单链DNA报告分子浓度及gRNA浓度分别为500 nmol/L、100 nmol/L;最佳孵育缓冲液为10%聚乙二醇,最佳反应时间为30 min。该方法仅对App的检测为阳性,而对副猪嗜血杆菌、猪链球菌、沙门氏菌、猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒、猪流行性腹泻病毒的检测结果均为阴性,特异性较强;敏感性试验结果显示该方法对App重组质粒标准品的检测下限可达10拷贝/μL,比普通PCR方法敏感性高1 000倍;重复性试验结果显示,该方法对3个不同稀释度重组质粒标准品的批内和批间重复性试验检测结果均一致,重复性较好。对40份小鼠的肺脏病料样品进行检测,结果显示本研究建立的方法检出27份阳性样品,且通过试纸条即可直接观察结果。常规PCR方法检出25份阳性样品,二者的符合率为95%。本研究所建立的方法具有操作简单、快捷、结果直观,无需昂贵设备等优点,为现地快速检测该病原提供了一种切实可行的技术手段。

摘要：建立基于RPA/crispr-cas12a技术单核细胞增生李斯特菌的快速检测方法。选取单增李斯特菌溶菌素毒力基因hly(GeneID:987033),设计重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)引物结合crispr-cas12a蛋白研制两步法单增李斯特菌快速检测试剂盒,并对其灵敏度、特异性以及反应速率进行分析。结果表明:该法检测速率快,30 min内可检出单核细胞增生李斯特菌,同时具有较高的灵敏度,20μL体系可检测到最低0.0015 ng靶标核酸。将该试剂盒进一步用于检测人工模拟污染食品三文鱼肉片,检测限可达10 CFU/mL。本方法检测30份实际样本,结果均与荧光定量聚合酶链式反应法阳性检出率一致。RPA/crispr-cas12a技术是快速检测食源性单增李斯特菌的可行方法。

摘要：[目的]建立禽源多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌的可视化检测方法。[方法]将重组酶聚合酶扩增(RPA)与成簇规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白(crispr-cas)系统相结合,针对两种病原菌设计特异性crispr相关RNA(crRNA)序列,筛选RPA引物,并对crispr检测体系进行优化,探究单管双靶标扩增体系,评估检测方法的特异性及灵敏度,验证临床样品检测的可行性。[结果]本研究建立的检测方法最优组合为:Buffer中Mg^(2+)浓度20 mmol/L、cas12a蛋白80 nmol/L、crRNA 400 nmol/L、ROX荧光探针14μmol/L。特异性及灵敏度检测结果显示,本研究建立的检测方法特异性良好,在蓝光下观察,灵敏度与实时荧光定量PCR一致,比普通PCR高100倍。临床样品检测结果显示,巴氏杆菌、大肠杆菌均被有效检出,本研究所建立方法的临床符合率为100%。[结论]本研究成功建立了禽源多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌的可视化检测方法,其特异性及灵敏度较高,可以准确检测临床样品中的目标病原菌。试验结果为监测与防控禽源细菌性疾病提供了新方法。

摘要：根据传染性皮下和造血器官坏死病毒(IHHNV)基因序列的保守区域设计并合成多组RPA引物和特异性crRNA,经过筛选与优化,建立RPA-cas12a系统荧光检测法和试纸条法2种可视化快速检测IHHNV的方法。结果显示,这2种可视化检测方法在37℃恒温反应40 min可检测出IHHNV;与对虾白斑综合征病毒、虾肝肠胞虫和十足目虹彩病毒1无交叉反应;该方法灵敏度较高,最低检测浓度为10 copies/μL;应用该方法对10份IHHNV阳性临床样本进行检测,阳性检出率为100%。综合结果表明,建立的荧光法和试纸条2种可视化检测IHHNV的方法操作简单,反应灵敏,适用于对虾养殖场或基层实验室对IHHNV的定期监测和初筛。