摘要：利用crispr-cas9基因编辑技术敲除人Huh7肝癌细胞的血管紧张素转化酶2(ACE2)基因,构建ACE2基因敲除细胞株,为研究ACE2在肝细胞癌的作用提供细胞模型。首先,对ACE2结构域进行鉴定,利用在线网站设计两条破坏所有结构域、靶向作用于ACE2外显子的sgRNA。其次,构建重组载体并转染肝癌细胞Huh7,嘌呤霉素筛选出单克隆细胞株。最后,免疫印迹鉴定敲除效果。结构域鉴定结果显示,在340-520号氨基酸位置存在Zn结合位点和激活位点,根据sgRNA靶点设计原则,采用片段敲除的方式,针对ACE2的第9、第10外显子设计两对sgRNA,并成功构建PX459-ACE2-sgRNA重组质粒。嘌呤霉素成功筛选出单克隆细胞株,并测序证实了发生片段敲除,ACE2蛋白在敲除细胞株中不表达;成功构建ACE2敲除的Huh7细胞株,为日后研究ACE2在肝细胞癌的发生机制奠定基础。

摘要：crispr-cas9是一种现代生命科学研究中普遍使用的新型基因编辑技术。为了升级课程内容体系,使实验教学贴近科研实际,提升实验课程教学质量,设计了T7核酸内切酶1(T7E1)检测crispr-cas9基因编辑效果实验。以crispr-cas9基因编辑技术对mfn1编辑过的HeLa细胞为实验材料,提取基因组DNA,PCR扩增mfn1基因片段,切胶回收后,变性,退火,使用T7E1对编辑效果进行检测。经1%琼脂糖凝胶电泳,可观察到T7E1将略大于500 bp的mfn1基因片段切成两条大小约为250 bp的DNA片段,表明crispr-cas9成功地对mfn1进行了编辑。

摘要：为研究甲基胞嘧啶双加氧酶2(tet methylcytosine dioxygenase 2,TET2)及其介导的羟甲基化修饰在调控天然免疫反应中的作用,利用crispr-cas9基因编辑技术构建TET2基因敲除的鸡胚成纤维细胞系。针对鸡TET2 mRNA的2种剪接变体的共有CDS序列设计4组sgRNA,构建sgRNA表达质粒,连同cas9-T2A-GFP质粒共转染DF-1细胞,筛选高切割效率的sgRNA;将转染该sgRNA的DF-1细胞,进行流式细胞分选,获取表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的细胞,再通过有限稀释法筛选单克隆细胞,并用DNA测序进行鉴定。单克隆敲除细胞扩大培养后,Western blot和Dot blot检测TET2蛋白的表达水平和羟甲基化(5hmC)水平。DNA测序结果表明,TET2-gRNA-2靶位点附近分别发生2和28 bp的缺失突变,引起TET2蛋白移码突变,将该细胞株命名为DT-6。DT-6细胞传代15次以上,细胞形态稳定。Western blot结果显示,与DF-1细胞相比,DT-6细胞几乎不表达TET2蛋白。Dot blot结果显示,与DF-1细胞相比,DT-6细胞全基因组羟甲基化水平显著降低。利用crispr-cas9技术成功构建了敲除TET2基因的鸡胚成纤维细胞系,为研究鸡TET2及其介导羟甲基化修饰参与调控天然免疫反应的途径和分子机制奠定基础。

摘要：为创制番茄雄性不育系,利用crispr-cas9技术对番茄雄性不育基因SlTM6进行定向编辑,在SlTM6基因第一外显子区域设计两个靶位点,构建crispr-cas9基因敲除载体,并通过农杆菌转化番茄优异自交系T048。对8株转基因阳性株系进行靶位点序列分析发现,共有6株发生了编辑事件,编辑效率为75%,其中,双等位编辑株系表现为柱头外露,雄蕊发育不完全且无花粉活性,而杂合编辑株系可育。对T0代杂合编辑株系进行继代培养后获得无外源载体成分的纯合雄性不育株系,同时开发分子标记并进行验证。本研究表明,通过crispr-cas9技术对雄性不育基因SlTM6进行定向编辑可快速创制雄性不育番茄新种质。

摘要：乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)能引起患者慢性感染,增加肝硬化和肝癌的风险,是威胁全球健康的一个重要问题.核苷(酸)类似物(NUCs)和干扰素(IFN)是目前治疗HBV仅有的两类药物,然而这两类药物均无法清除稳定存在于细胞核中且能够作为模板产生子代病毒的闭合共价环状DNA(covalently closed circle DNA,cccDNA).此外,HBV耐药相关突变(RAM)和疫苗逃逸突变(VEM)降低了现有治疗和预防策略的成功率.因此,人们在努力开发直接靶向cccDNA,将之失活或清除以实现治愈慢性乙肝的治疗手段.特异性靶向HBV基因组保守区域的crispr-cas9基因编辑系统,不仅能够有效抑制病毒复制,相比其他基因编辑工具,设计也更加简单灵活,成为了一个十分具有吸引力的治疗选择.本文将总结现有crispr-cas9系统在抗乙型肝炎病毒中的研究,并探讨其可能面临的问题与潜在的解决方案.

摘要：背景与目的:Notch信号转导通路对鼻咽癌的发生、发展及维持肿瘤干细胞的自我更新等具有重要作用,既往研究方法难以使Notch通路中特定基因功能完全丧失。本研究旨在利用crispr-cas9基因编辑技术构建Notch1基因敲除的CNE2鼻咽癌细胞系,并观察Notch1敲除对CNE2细胞增殖、辐射敏感性的影响。方法:采用蛋白质印迹法(Western blot)检测人鼻咽癌细胞CNE2及鼻咽正常上皮细胞NP69中Notch1表达水平;利用sgRNA在线设计工具,针对Notch1设计sgRNA;利用PX459质粒构建含sgRNA的敲除载体PX459-Notch1-sgRNA;将质粒瞬时转染CNE2细胞,经过药物筛选、克隆化培养、Western blot检测、免疫荧光染色验证得到Notch1敲除的CNE2鼻咽癌细胞系;采用细胞计数试剂盒(Cell CountingKit-8,CCK-8)检测方法、克隆形成实验检测Notch1敲除组(Notch-KO)与未转染亲本组(Parental)、转染PX459空载体水平较的对照组(Ctrl)的增殖活性及辐射敏感性,并进一步采用流式细胞术检测侧群细胞比例。结果:与NP69细胞相比,CNE2细胞中Notch1蛋白水平较高;Western blot检测、免疫荧光染色验证Notch1基因被完全敲除。Notch1基因敲除可抑制细胞增殖活性(P<0.05);Notch1-KO组的D0、Dq和SF2值分别为1.160、1.881和0.630 Gy,低于Parental(1.176、2.533和0.824 Gy,P<0.001)和Ctrl组(1.182、2.516和0.819 Gy,P<0.001);Notch1-KO中侧群细胞比例[(1.13±0.01)%]较Parental[(3.81±0.03)%]、Ctrl[(3.70±0.03)%]明显下降(P<0.001)。结论:运用crisprcas9技术可成功敲除CNE2细胞中的Notch1基因,Notch1基因敲除导致CNE2细胞增殖能力下降、辐射敏感性增加、侧群细胞比例降低。

摘要：目的分析、探讨crispr-cas9体外和体内非病毒递送系统及其在疾病治疗中的应用。方法选取非病毒crispr-cas9递送系统为本次分析对象,对比分析非病毒载体相较于病毒载体的优缺点;探讨现有非病毒递送系统,主要包括:脂质纳米颗粒、聚合物纳米颗粒、金纳米粒子、细胞穿透肽、丙烷甜菜碱诱导转导离子、黑磷和外泌体等在疾病治疗中的应用。结果通过对非病毒crispr-cas9递送系统分析发现,基于非病毒载体介导的crispr RNP递送系统显示出了诸多优势,且具备低脱靶效应、低免疫原性以及较高安全性、递送效率、靶向性和稳定性等。结论非病毒crispr-cas9递送系统的持续优化将加速crispr-cas9技术在遗传病、癌症等疾病治疗中的临床转化与应用。

摘要：水稻CYP81A6基因(Bel)编码的细胞色素P450单加氧酶对苯达松和磺酰脲类除草剂具有抗性,该基因的隐性纯合突变体(bel)表现为苯达松敏感致死性,可作为植物化学致死标记,在水稻杂交制种中具有重要的应用价值。本研究在CYP81A6基因的首个外显子中设计两个靶位点,构建了含多靶点的crispr-cas9载体,通过根癌农杆菌介导法转化粳稻中花11,获得了56株转基因T0代阳性植株,提取其中9株基因组DNA进行靶位点测序检测,发现基因敲除突变率为77.8%,其中纯合突变率高达71.4%,对纯合突变体水稻喷施苯达松,均表现出对苯达松敏感致死。为应用crispr-cas9技术培育苯达松敏感致死水稻不育系和对其他水稻基因进行编辑提供理论依据。

摘要：以甜瓜品种"老汉瓜"为试材,采用crispr-cas9基因组编辑技术,研究了构建crispr-cas9系统敲除甜瓜ACC合成酶基因表达载体的方法,以期获得高效的敲除甜瓜基因的基因组编辑技术。结果表明:以甜瓜ACC合成酶的基因设计出引物后,将其构建到pP1C.4载体上,用热激法将连接产物转化到大肠杆菌中,筛选的阳性克隆测序验证为最终载体。

摘要：尝试利用crispr-cas9系统敲除山羊基因组中β-乳球蛋白(BLG)基因,以实现在BLG基因座敲入人乳铁蛋白(h LF)基因,并进一步探讨了不同浓度RAD51蛋白激活剂(RS-1)对同源重组效率的影响。首先针对山羊BLG的第一外显子设计并构建了sg RNA和cas9共表达载体p cas9-sg BLG,将该载体转染至山羊耳成纤维细胞,利用PCR和T7EN1法验证了其基因组编辑活性;然后进一步构建了BLG基因打靶载体p BHA-h LF-NIE(包含NEO/EGFP);将该打靶载体与p cas9-sg BLG载体共转染至山羊耳成纤维细胞,分别用0、5、10和20μmol/L RS-1处理细胞,分析了绿色荧光蛋白的表达效率;同时用800μg/m L G418对不同浓度RS-1处理后的细胞进行筛选,挑取EGFP阳性细胞克隆,进一步通过PCR和测序鉴定h LF定点敲入的阳性细胞克隆。结果显示:设计的sg RNA编辑山羊BLG位点的效率为25%-31%;报告基因的表达效率提示RS-1可以促进基因敲入效率的提高,其效率与RS-1浓度呈正相关,20μmol/L RS-1处理组的效率是对照组的3.5倍;利用G418筛选h LF敲入阳性细胞克隆后,当RS-1浓度为0-10μmol/L时,h LF敲入效率随着RS-1浓度增加而升高,在10μmol/L时阳性克隆率最高为32.61%,然而在20μmol/L时敲入阳性克隆率下降至22.22%,且衰老细胞克隆增多。以上结果表明,利用crispr-cas9系统可以实现在山羊耳成纤维细胞中敲除BLG基因和敲入h LF基因,且适宜浓度的RS-1可以显著提升基因敲入效率,本试验为高效利用crispr-cas9系统获得基因敲入的细胞提供了参考依据。