摘要：基因特异性敲除的细胞常用于生物学研究。近些年兴起的crispr-cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats-cas9 nuclease)基因编辑技术越来越广泛地用于基因特异性敲除的实验中。本实验通过利用crispr-cas9基因编辑技术,实现对大鼠心肌H9c2细胞Tudor-SN(tudor staphylococcal nuclease)基因的敲除,并观察其对H9c2细胞周期及增殖的影响。选择PX462质粒为载体,利用软件设计能特异性识别H9c2细胞Tudor-SN基因第2个外显子的上下游sgRNA(single-guided RNA),构建1对重组质粒。随后,将这对质粒共同转入H9c2细胞中,再挑选阳性单克隆细胞进行培养。Western印迹鉴定其敲除效果,并用敲除成功的细胞株通过流式细胞术及CCK-8(cell counting kit 8)实验进行细胞周期和增殖的检测。Western印迹结果显示,在阳性细胞中,Tudor-SN蛋白不表达,成功实现了对Tudor-SN基因的敲除。流式结果显示,Tudor-SN基因敲除(KO)细胞发生了G1期阻滞。G1期细胞占比由H9c2野生型(WT)细胞的54.28%±0.21%升高到KO细胞的61.96%±0.40%(*P<0.05)。CCK-8实验结果显示,KO细胞的增殖速率减慢。生长第6天的A值由WT细胞的2.82±0.03降低到KO细胞1.85±0.19(*P<0.05)。本实验成功构建了H9c2细胞Tudor-SN基因敲除细胞株,并检测到Tudor-SN基因敲除对细胞周期的阻滞及增殖的抑制,为研究Tudor-SN基因对心肌细胞功能的调控提供了便利的工具及研究的基础。

摘要：为解决传统茶叶育种成活率低的问题,基于crispr-cas9基因编辑技术设计茶叶育种方法。通过crispr-cas9基因编辑技术,敲除茶叶育种致死基因;将sgRNA:pcocas9茶叶育种优质基因导入茶叶树苗,敲入茶叶育种优质基因;利用非末端同源连接,实现茶叶育种。设计实例分析,结果表明,设计方法茶叶育种成活率明显高于对照组,能够解决传统茶叶育种成活率低的问题。

摘要：利用crispr-cas9基因编辑技术对拟南芥真核生物释放因子1-1(eukaryotic release factor 1-1,ERF 1-1)基因进行高效率的靶向突变以获得该基因突变体,观察突变体表型并进一步探索ERF1-1基因在拟南芥中生长发育中的功能.根据原间隔序列邻近模块序列(protospacer adjacent motif,PAM)的特异性,选择1对位于ERF1-1基因内部的靶点序列,并设计1对向导核糖核酸(guide ribonucleic acid,gRNA),将与这对gRNA序列碱基互补配对的脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)序列构建到pHEE401载体中.将构建好的重组质粒转化到农杆菌GV3101菌株,接着利用含有重组质粒的农杆菌对拟南芥花序进行滴花法侵染.用含有潮霉素的培养平板筛选转基因T1代阳性苗并传代培养,通过测序检测每一代植株靶点附近是否发生编辑.采用目前最有效的crispr/cas9基因靶向编辑技术突变拟南芥ERF1-1基因,成功获得了一系列不同形式的ERF1-1基因突变植株,在正常生长条件下ERF1-1突变植株与野生型相比具有轻微的生长发育缺陷表型.根据erf1-1突变植株的表型推测ERF1基因家族的成员ERF1-1、ERF1-2和ERF1-3可能在功能上冗余.研究成果可为后续拟南芥ERF1基因功能研究提供遗传学方面的数据.

摘要：目的利用crispr-cas9基因编辑技术构建树突状细胞相关C型凝集素-1(Dectin-1)基因缺失小鼠模型,研究Dectin-1基因缺失对小鼠肿瘤生长的影响。方法通过crispr-cas9基因编辑技术设计靶向目的基因的sgRNA实现cas9蛋白对DNA双链的特异性切割。将体外转录纯化得到的sgRNA和ssDNA并与cas9混合后,通过显微注射到C57BL/6小鼠的受精卵内并经胎盘移植到代孕小鼠体内,获得F0代小鼠。F0代小鼠通过基因鉴定和DNA测序获得Dectin-1基因缺失阳性子代小鼠。最后构建野生型与Dectin-1敲基因小鼠的肿瘤模型,经β-葡聚糖治疗后,观察两组小鼠的肿瘤生长情况。结果利用crispr-cas9基因编辑技术成功敲除C57BL/6野生型小鼠的Dectin-1基因。PCR技术及DNA测序进一步显示Dectin-1基因部分碱基缺失,功能实验显示Dectin-1敲基因小鼠口服β-葡聚糖后肿瘤生长速度高于对照组小鼠,差异有统计学意义(P<0.05)。结论利用crispr-cas9基因编辑技术构建Dectin-1基因敲除小鼠模型,验证了Dectin-1对β-葡聚糖抗肿瘤的影响,为进一步研究Dectin-1基因在肿瘤免疫治疗中的作用奠定了基础。