摘要：为建立可以同时检测猪瘟病毒(csfv)、猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)和猪圆环病毒2型(PCV2)的快速、敏感的检测方法,本研究根据Gen Bank中登录的csfv、PRRSV、PRV和PCV2 4种病毒的基因序列设计引物和探针,建立了一种能够用于同时检测这4种病毒的多重荧光定量PCR方法,并对其反应条件进行优化。结果显示,4种病毒的标准曲线相关系数均达到0.98以上,具有良好的线性关系。对csfv、PRRSV、PRV和PCV2以外的其他病毒株核酸扩增均呈阴性,具有较强的特异性。灵敏度试验结果显示,该方法对这4种病毒的最低检测量均能达到10拷贝/μL。此外,该检测方法的批内和批间重复性试验变异系数均小于5%,表明所建立的方法具有很好的重复性。利用建立的方法对59例疑似猪繁殖障碍疾病样本进行检测,结果显示,单一病毒感染样本7例,阳性率为11.86%;2种或3种病毒混合感染阳性率为44.07%(26/59);无4种病毒同时感染的样本。以上结果表明所建立的检测方法具有快速、准确、特异性好、灵敏度高等特点,能够对csfv、PRRSV、PRV和PCV2病毒同时进行检测,可以用于相关疫情的监测及防控。

摘要：猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(csfv)和猪圆环病毒Ⅱ型(PCV-2)是引发猪繁殖障碍的主要病原,建立其基因芯片快速检测体系,对开发猪繁殖障碍快速检测试剂盒具有重要意义。根据GenBank中已发表的PRRSV、csfv和PCV-2的病毒基因组序列,设计合成特异性引物和特异性较强的60mer的寡核苷酸探针,并将探针按所设计阵列固定于表面经氨基化修饰的玻片上,制备出寡核苷酸芯片。通过引物标记及特异性验证,建立了带标记引物的多重PCR检测体系,从而产生大量可与寡核苷酸探针特异性互补的带标记的DNA片段。将标有荧光染料的扩增产物与芯片上寡核苷酸探针杂交,扫描、分析芯片上荧光信号。结果表明,芯片上各样本对应探针位点呈现阳性荧光信号,而阴性对照和空白对照则基本不能检测到荧光信号。分别用基因芯片检测方法和PCR/RT-PCR检测60份临床病料,两者符合率高达92%,表明该检测技术能够用于临床病料的检测及快速诊断PRRSV、csfv和PCV-2。

摘要：通过对Genbank登录的csfv、PRRSV和JEV的核苷酸序列进行比对分析,找出csfv的E2基因,PRRSV的Nsp2基因和JEV的E基因为相对保守区域[1]。利用生物学软件在保守序列分别设计一对引物,通过对PCR反应条件的优化,确定了最佳引物浓度、最佳Mg2+浓度和最佳退火温度,建立了多重二温式PCR方法检测csfv、PRRSV和JEV。其扩增的目的片断大小分别为csfv(482 bp)、PRRSV(576 bp)和JEV(375 bp),将传统三温式PCR过程中的退火与延伸合并为一步,从而大大节省临床检测时间,同时又能通过一个反应体系对csfv、PRRSV及JEV三种猪主要RNA病毒病进行检测。用50份临床病料对本研究多重PCR技术和单项PCR技术进行对比验证,结果显示,两者的总符合率为93%以上。表明建立的多重PCR检测方法,具有特异、快速、准确的特点,可用于对这3种病毒的同时检测和鉴别诊断。

摘要：为研究高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)TJM-F92疫苗株对猪瘟病毒(csfv)C株的间隔免疫干扰情况,本实验设计在免疫高剂量PRRSV TJM-F92株疫苗毒后第7 d和第14 d分别免疫低剂量csfv C株疫苗毒,并于csfv C株疫苗毒免疫后第14 d用csfv石门系血毒攻击实验动物,通过体液免疫水平、免疫攻毒保护水平及病理学变化等方面进行评价。结果表明,间隔7 d免疫组与间隔14 d免疫组csfv ELISA抗体水平与csfv C株单独免疫对照组抗体水平无显著差异;攻击csfv石门系血毒后,间隔7 d免疫组与间隔14 d免疫组均未出现猪瘟临床症状,组织器官病理变化轻微,对csfv石门系血毒攻击可产生良好的保护效果。CSF阴性对照组实验动物5/5表现出猪瘟明显临床症状并全部死亡。以上结果表明,高剂量PRRSV TJM-F92疫苗株与低剂量csfv C株间隔7 d或14 d免疫,PRRSV TJM-F92株对csfv C株无免疫干扰作用。

摘要：参照GenBank中相关的基因序列,设计了6对引物分别用于扩增PRV gE、PPV NS1、PCV ORF2、PRRSV ORF7、csfvE2、JEVE基因的部分片段。敏感性和特异性试验结果表明,该mPCR对6种病毒的最低核酸检测量分别为PRV 6.6pg、PPV 96pg、PCV 12.9pg、PRRSV 10.5pg、csfv 51pg、JEV 46pg,对猪流感病毒(SIV)、大肠杆菌(***)的扩增结果均为阴性。103份临床病料检测结果表明,上述6种猪病毒性疫病在贵州省猪群中普遍存在且混合感染情况严重。该六重PCR方法不仅实现了上述6种病毒的同时检测,更实现了DNA病毒及RNA病毒的同步检测,能够对PRV、PPV、PCV、PRRSV、csfv、JEV单个或混合感染的临床病料进行快速鉴别诊断。

摘要：为建立同时鉴别检测猪传染性胸膜肺炎放线杆菌（APP）、副猪嗜血杆菌（HPS）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪肺炎支原体（Mhp）、猪圆环病毒2型（PCV2）和猪瘟病毒（csfv）这6种病原的寡核苷酸芯片方法,根据这6种病原的特异保守序列,设计了6对特异性引物和探针,建立多重PCR体系,优化杂交参数,进行方法评估。结果显示,该方法检测APP、HPS、Mhp、PCV2、PRRSV及csfv的灵敏度分别为5.8×10^2copies/L、7.8×10^3copies/L、6.8×10^3copies/L、6.3×10^2copies/L、4.8×10^3copies/L、5.5×10^2copies/L,且与猪源伪狂犬病病毒、猪细小病毒、日本乙型脑炎病毒、猪水疱病病毒、水泡性口炎病毒、口蹄疫病毒、蓝舌病病毒、小反刍兽疫病毒及沙门菌等9种病原无交叉反应。用建立的多重PCR对186份临床样本的检测结果显示,单一感染率为18.3%（34/186）,混合感染率为5.9%（11/186）,与测序验证完全一致。该方法为多种病原的流行病学调查和临床诊断提供了一种快速、高通量的检测手段。

摘要：为建立猪瘟病毒(csfv)和牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的鉴别检测方法,本研究根据csfv Npro基因、BVDV 5'-UTR基因保守区域设计特异性引物和Taq Man探针,构建阳性重组质粒,优化反应条件,建立了双重RT-q PCR检测方法。该方法 csfv和BVDV的检测灵敏度均为100拷贝/μL,具有良好的特异性和重复性;对206份猪病料进行检测,csfv阳性59份、BVDV皆为阴性,与本实验室常用单项RT-q PCR试剂盒检测结果一致。本研究建立的双重RT-q PCR整个检测过程不到3 h,采取闭管反应,检测完毕直接处理,避免开盖造成气溶胶污染,具有简单、快捷、灵敏度高、生物安全性好等优点,可用于csfv和BVDV的临床鉴别检测,为2种病毒的交叉污染的检测提供一种方便、快捷的方法。

摘要：参考GenBank中牛病毒性腹泻病毒（BVDV）和猪瘟兔化弱毒病毒（HCLV）序列，设计和建立了一种PCR检测方法，通过试验证明，所建方法能够对HCLV和BVDV进行鉴别诊断；用此方法对23个批次的猪瘟细胞苗进行检测，发现有5批疫苗污染BVDV，均为BVDVI型，污染率为21．74％。测定序列与BVDVOregonC24V株（AF091605）的核苷酸相似性为83．2％～83．5％，与NADL株（M31182）的核苷酸相似性为86．4％～86．7％。

摘要：为建立运用多重PCR和基因芯片技术同时检测5种猪繁殖障碍性病毒病的方法。本研究根据GenBank中登录的猪瘟病毒(csfv)、猪细小病毒(PPV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪日本乙型脑炎病毒(JEV)及猪圆环病毒2型(PCV2)的基因序列设计特异性引物与探针,制备相应的寡核苷酸芯片,检测了5种猪繁殖障碍性疾病病毒的标准毒株,并对16份临床样品进行检测。通过多重PCR扩增出带有荧光标记的5种病毒的特异性基因片段,并与固定有特异性探针的基因芯片杂交。结果显示,本研究建立的多重PCR结合基因芯片检测方法特异性强、稳定性好,灵敏度可达10~2拷贝/μL。16份临床样品检测结果显示阳性率达87.5%(14/16)。以上结果表明该方法特异性好、灵敏度高,可高效检测以上5种病毒,为其临床诊断及流行病学调查提供了有效的检测方法。

摘要：根据GenBank中PRRSV ORF6、PCV2 ORF2、PPV NS1、PRV gB、SIV M、JEV NS1、csfv E2等基因的部分片段,分别设计特异性引物,用实验室已保存的病毒及阳性病料,通过对7个病毒单一PCR的退火温度和敏感性进行优化和检测,再选择合适的多重PCR缓冲体系及酶,优化退火温度、模板及引物浓度,最后检测多重PCR的敏感性、特异性及重复性,建立一种能够同时且快速鉴别PRRSV、PCV2、PPV、PRV、SIV、JEV和csfv这7种常见猪呼吸道和繁殖障碍类病毒的多重PCR检测方法,并用其对2017-2019年贵州部分地区的150份临床病料进行检测。多重PCR特异性检测结果表明:从混合病毒基因组中分别扩增出大小为224,353,424,549,684,831,1 137 bp的特异性片段,未扩增出***、APP、PEDV及正常组织的DNA/RNA;敏感性试验表明,该方法对病毒的最低检测量分别为PRRSV 94 pg、PCV2 66 pg、PPV 68 pg、PRV 20 pg、SIV 35 pg、JEV 17 pg、csfv 14 pg;重复性试验表明:相同条件下的6次重复试验均能扩增出7个病毒的目的条带;应用试验表明:150份临床病料中二重感染阳性率高达66.00%(99/150);三重感染阳性率达11.33%(17/150);四重感染阳性率达2.00%(3/150);五重感染阳性率达0.67%(1/150);六重感染阳性率为0,七重感染阳性率为0,阳性PRRSV、PCV2、PPV、JEV、SIV的多重PCR与单一PCR的符合率均为100.00%,阳性csfv和PRV的符合率为90.00%以上,研究建立的多重PCR检测方法具有敏感性高、特异性强、重复性好的特点,对猪场猪呼吸和繁殖障碍类病毒病混合感染的快速诊断具有十分重要的意义。