摘要：目的 根据毕赤酵母密码子偏好,设计并改造人ctla4胞外区cDNA,构建毕赤酵母分泌型表达载体,以实现人ctla4胞外区蛋白在毕赤酵母中的高效表达。方法利用PCR定点突变技术,将人ctla4胞外区cDNA中的毕赤酵母低频使用密码子突变成高频使用密码子而不改变其氨基酸序列;经DNA序列测定证实后插入毕赤酵母高拷贝表达载体pPIC9K a分泌信号下游,SacⅠ线性化后电转GS115;G418梯度筛选转化菌;PCR鉴定目的基因整合;甲醇诱导表达,SDS-PAGE、Western blotting、肽质量指纹等鉴定表达蛋白。结果成功地对人ctla4胞外区cDNA进行了定点突变,该突变体在毕赤酵母中能成功表达ctla4胞外区蛋白。结论 为高效表达人ctla4胞外区蛋白及其功能研究和临床应用奠定了基础。

摘要：目的:基于CRISPR/Cas9基因编辑技术原理体外合成定向编辑细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4,ctla4)基因的向导RNA(small guide RNA,sgRNA)。方法:(1)使用Crispr网站对ctla4位点的sgRNA进行预测并设计出3个sgRNA(sgRNA1、sgRNA2、sgRNA3),构建sgRNA重组质粒,将其转染293T细胞,48 h后提取基因组DNA,利用T7EN1核酸内切酶筛选活性较高的sgRNA序列;(2)以筛选到的sgRNA重组质粒为模板,设计引物并用PCR扩增体外合成sgRNA的DNA模板片段,进一步优化体外转录条件,转录出sgRNA,并利用Cas9核酸酶体外检测转录纯化sgRNA的切割效率;(3)将sgRNA与转录得到的Cas9 mRNA电转化入肺癌患者CD3^+T细胞,实现靶基因敲除。结果:T7EN1核酸内切酶实验证实了sgRNA2序列靶向敲除效率最高,效率达到66%;优化体外合成体系后,转录得到的ctla4 sgRNA2产量高,具有较高的活性,在靶点上成功切开了DNA双链,Cas9核酸酶检测出其切割效率达到了65%;最终可在肺癌患者CD3^+T细胞中有效敲除ctla4基因,ctla4分子的表达从46%降低到22%,T7E1核酸内切酶实验进一步证实了其编辑效率为56%。结论:体外成功构建了具有较高编辑效率的定向编辑ctla4基因的sgRNA,为后续针对该基因制定相应的免疫治疗策略奠定了基础。