摘要：【目的】利用CRISPR/Cas9系统构建稳定敲除anxa6基因的caco-2细胞株,为研究大肠杆菌O157:H7效应蛋白EspF与宿主膜联蛋白A6(ANXA6)相互作用及其致病机制奠定基础。【方法】根据CRISPR/Cas9靶向原理设计并合成3个特异性识别anxa6基因的向导RNA(single guide RNA,sgRNA),基于LentiCRISPRv2载体构建LentiCRISPRv2-sgRNA重组质粒,转入293T细胞中,制备sgRNA-Cas9慢病毒,将慢病毒感染caco-2细胞,经嘌呤霉素筛选阳性细胞,有限稀释法分离培养单克隆细胞,提取单克隆细胞基因组DNA,并对敲除位点附近的DNA片段进行PCR扩增,测序并进行脱靶效应评估;免疫印记法检测ANXA6蛋白表达情况,细胞计数试剂盒8(cell counting kit 8,CCK8)试剂盒检测细胞增殖能力,免疫荧光法检测细胞紧密连接分布情况。【结果】Western blotting及序列测序表明anxa6基因敲除单克隆细胞构建成功;脱靶效应评估结果显示预测的10个脱靶位点均无脱靶现象;基因敲除对细胞增殖能力无明显影响;免疫荧光结果显示,caco-2及caco-2anxa6‒/‒细胞紧密连接蛋白ZO-1均沿细胞膜连续分布,结构完整,转染EspF质粒后出现分布不完整、缺口等现象。【结论】成功构建anxa6基因稳定敲除的caco-2细胞株,初步探索ANXA6蛋白在紧密连接分布中的作用,为进一步研究大肠杆菌O157:H7通过EspF-ANXA6互作介导宿主肠屏障损伤分子机制提供技术支撑。

摘要：目的研究岩白菜素透膜吸收机制及促吸收方法,为优化安全、稳定、有效的渗透泵制剂奠定基础。方法 围绕难溶性药物渗透泵制剂设计各相关因素,测定各转运样品在caco-2细胞单层模型中的表观渗透系数Papp值及转运速率。结果 岩白菜素Papp值随浓度的增加变化不大,流出率ER值均小于1.5。分别与3种挥发油及3种皂苷合用后,岩白菜素Papp值及转运速率均显著增加;2种制剂增溶技术及渗透泵制剂常用的两种亲水性高分子辅料对岩白菜素Papp值没有明显影响。结论 岩白菜素未表现出主动转运特性;本实验揭示了岩白菜素渗透泵制剂设计的可能方向。

摘要：目的制备并优化田蓟苷固体脂质纳米粒(T-SLNs),对其理化性质及体外吸收和转运进行考察。方法采用高剪切乳化超声法制备了T-SLNs,利用星点设计-效应面法(CCD-RSM)对其制备工艺进行了优化,并对其平均粒径、多分散性指数(PDI)、Zeta电位、形态、包封率及体外释放等特性进行了考察,使用caco-2细胞模型模拟小肠上皮细胞,对T-SLNs在caco-2细胞中的吸收和转运进行了考察。结果 T-SLNs的最佳制备工艺:药脂比(质量比)0.11,大豆卵磷脂与脂质质量比1.26,聚山梨酯-80用量50.5 mg/m L,所制备的T-SLNs外观呈球形或类球形,大小相近,分散均匀,平均粒径为(86.40±0.62)nm,PDI为0.165±0.080,Zeta电位为(-24.2±0.6)m V,包封率为(89.81±1.07)%,在磷酸盐缓冲溶液(p H 6.8)中48 h累积释放率为(98.72±1.57)%。T-SLNs在caco-2细胞模型中的吸收和转运均高于田蓟苷组。结论高剪切乳化超声法制备T-SLNs的工艺稳定可行,制备的T-SLNs具有较小的粒径和较高的包封率,相同浓度下T-SLNs在caco-2细胞模型中的吸收和转运均高于田蓟苷组。

摘要：柠檬苦素广泛存在于柑橘类水果中,具有抗菌、抗病毒、镇痛、抗炎和抗癌等活性,但其口服生物利用度较低。本文意在研究柠檬苦素在肠道内的吸收机制,为其今后的研究奠定基础。实验通过大鼠原位肠灌流和体外caco-2细胞法进行。大鼠原位肠灌流结果显示,柠檬苦素可能通过肠道促进扩散机制吸收,吸收差且在全肠段都有吸收,没有部位选择性。caco-2细胞实验结果显示,维拉帕米和酮康唑能显著提高柠檬苦素的吸收,而丙磺舒的影响不明显。柠檬苦素吸收较低和生物利用度较差,可能是P-gp外排以及CYP3A4代谢共同参与的结果。柠檬苦素的肠吸收机制研究将为其剂型设计和临床应用提供重要的参考。

摘要：本研究通过脂多糖(LPS)诱导建立了caco-2细胞体外肠炎模型,探究不同聚合度(DPs)灵芝β-葡寡糖的抗炎活性和作用机制。比较白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)以及活性氧(ROS)的水平可知,不同聚合度灵芝β-葡寡糖组分均能抑制LPS诱导的caco-2细胞中IL-1β、TNF-α及ROS的释放;进一步通过蛋白免疫印迹法(Western blot)对其抗炎机制进行探究,发现灵芝β-葡寡糖能显著降低LPS诱导的caco-2细胞NF-κB p65蛋白的水平。说明灵芝β-葡寡糖能通过调节NF-κB p65蛋白的表达下调炎症因子水平、减少细胞内氧化应激,从而在肠细胞中产生抗炎作用,其中聚合度为8-24的F3组分作用效果最佳。本研究可为灵芝β-葡寡糖在抗炎功能活性中的应用提供理论基础。

摘要：设计3种黏附试验分别研究了嗜酸乳酸杆菌和S-层蛋白对产肠毒素大肠杆菌黏附caco-2细胞的影响。结果显示:在置换试验中,嗜酸乳酸杆菌及S-层蛋白对产肠毒素大肠杆菌黏附caco-2细胞没有影响;但在排斥试验和竞争试验中,嗜酸乳酸杆菌及S-层蛋白均对产肠毒素大肠杆菌黏附caco-2细胞产生明显的协同作用,在排斥试验中嗜酸乳酸杆菌及S-层蛋白分别增加产肠毒素大肠杆菌的黏附数量95.23%±4.22%(P<0.01)和352.30%±2.26%(P<0.01),在竞争试验中分别增加389.06%±3.35%(P<0.01)和55.57%±5.81%(P<0.05);并且S-层蛋白在排斥试验中,对产肠毒素大肠杆菌的协同黏附作用大于竞争试验中的协同黏附作用。可见,乳酸杆菌对产肠毒素大肠杆菌的协同黏附作用关键在于S-层蛋白,S-层蛋白可能起到"连接桥"的作用。

摘要：目的:研究祖师麻甲素在caco-2细胞模型中的吸收特性,为其及祖师麻给药途径的选择和剂型的合理设计提供依据。方法:采用caco-2细胞单层模型研究祖师麻甲素的摄取和跨膜转运,采用HPLC法检测药物浓度,计算其表观渗透系数,考察时间、温度、pH值、药物浓度以及P-gp抑制剂对祖师麻甲素吸收的影响。结果:祖师麻甲素以被动扩散为主要方式被细胞摄取和转运。药物的摄取与时间、温度和浓度呈正相关,不受媒介pH值的影响。祖师麻甲素从Basolateral-Apical方向转运要稍快于相反方向。随着药物浓度的增加,比值呈降低趋势,但变化不大。P-gp抑制剂维拉帕米对祖师麻甲素的转运无显著性影响。结论:祖师麻甲素是以被动扩散为主要方式被小肠上皮细胞摄取和转运,此过程不受P-gp的外排作用。

摘要：目的:评价caco-2细胞对酯类药物的水解活性及羧酸酯酶(CES)表达的影响.方法:采用人类CES1(hCE-1)和CES2(hCE-2)特异性底物咪达普利和伊立替康(CPT-11)与caco-2细胞S9组分共同孵育,HPLC法测定原药及代谢产物浓度,评价caco-2细胞的药物水解活性,并通过RT-PCR法测定细胞内hCE-1和hCE-2表达.结果:caco-2细胞与正常小肠微粒体酶相比,更倾向于代谢咪达普利,而几乎不水解***-PCR结果发现,caco-2细胞CES表达与正常肠道上皮组织不同,表现为hCE-1高表达,而几乎不表达hCE-2.结论:caco-2细胞CES表达与正常肠道上皮组织存在较大差异,因此在使用caco-2细胞评价酯类药物口服吸收时应十分谨慎.

摘要：目的制备黄芪甲苷(AST)纳米胶束(AST-NMs),并通过caco-2单层细胞转运实验评价其渗透性。方法以聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物(Pluronic F127)和D-α-维生素E聚乙二醇琥珀酸酯(TPGS)作为载体材料,采用冷冻干燥-水化法制备AST-NMs,并以Pluronic F127与TPGS质量比(X_(1))和聚合物与药物质量比(X_(2))作为变量因素,以AST-NMs的包封率(Y_(1))和粒径分布(Y_(2))作为评价指标,使用中心复合实验设计优化并得到AST-NMs的最优处方;采用差示扫描量热法(DSC)和透射电镜对AST-NMs进行表征;研究了AST-NMs在4种释放介质中的稀释稳定性以及体外药物释放特性;通过caco-2单层细胞转运实验比较了AST原料药与AST-NMs的渗透性。结果经优化得到AST-NMs的最优处方为:Pluronic F127与TPGS质量比为5∶1,聚合物与药物质量比为38∶1;DSC测定显示,AST-NMs中的药物吸热峰消失;在透射电镜下观察到AST-NMs呈球状分布,无聚集;AST-NMs经不同pH介质稀释后稳定性均较好,在4种释放介质中均表现为平稳的缓慢释药特征;AST-NMs在caco-2单层细胞的渗透性显著高于AST原料药。结论将AST制备成AST-NMs,可显著提高药物渗透性,有望提高生物利用度。

摘要：该文探讨甜蜜素联合柠檬黄对人克隆结肠腺癌细胞(caco-2细胞)损伤的机理,以高内涵细胞成像分析(high content analysis,HCA)技术为平台,析因设计实验方差分析为联合毒性的评价方法、实时荧光定量PCR(quantificational Real-time polymerase chain reaction,q RT-PCR)和Western blot为检测方法对此进行探究。结果表明,甜蜜素与柠檬黄均会显著地抑制caco-2细胞的增殖,且呈现剂量–效应关系,IC50分别为11.37±0.15 g/L和1.21±0.12 g/L。与单独组相比,联合组显著地升高细胞内Ca2+浓度、升高活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平、抑制细胞增殖、增大细胞膜通透性、降低线粒体膜电位。联合组在细胞内Ca2+浓度、ROS水平上表现为协同作用,在线粒体膜电位变化上表现为相加作用。q RT-PCR和Western blot显示,联合组显著提高Bax、细胞色素c(cytochrome c)、胱冬肽酶-3(caspase-3)等基因的表达,并上调Bax和下调Bcl-2的蛋白质水平,同时提高细胞色素c、剪切胱冬肽酶-3(cleaved-caspase-3)的蛋白质水平来抑制caco-2细胞增殖。