摘要：利用CRISPR/cas9基因编辑技术建立tau-V337M突变的阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)小鼠模型。通过设计和体外合成单向导RNAs(single guide RNAs,sgRNA)及单链寡核苷酸(single-stranded oligonucleotides,ssODN),将sgRNA、cas9蛋白、ssODN注射到小鼠受精卵内,利用DNA切割和重组产生突变。为了提高重组效率,又在注射时添加Rad51蛋白。使用自然交配的雌鼠作为受体,将2细胞期的编辑胚胎进行单侧输卵管移植。研究发现通过添加Rad51蛋白可以获得较高的突变效率,在F0小鼠中获得了tau-V337M小鼠并进行扩繁,F0代tau-V337M小鼠可以将突变遗传给F1代。综上所述,本研究利用cas9、ssODN和Rad51成功建立了首个tau-V337M基因位点突变的小鼠模型,为AD的研究和点突变模型制作提供了模型和方法基础。

摘要：目的建立敲除基因组中PDE10A基因的CRISPR/cas9系统。方法设计3个长20bp的sgRNA,分别靶向PDE10A的exon 6、exon 7和exon 11。化学合成sgRNA寡核苷酸序列,并克隆进PX330质粒中。将克隆正确的质粒PX330-sgRNA转染至HEK293T细胞中,提取基因组DNA并对敲除位点附近的DNA片段进行PCR扩增,再通过SURVEYOR分析和一代测序对敲除效率进行检测。最后采用有限稀释法挑选稳定敲除PDE10A的HEK 293T细胞株。结果目的sgRNA寡核苷酸双链成功插入PX330质粒中且序列正确;靶向Exon 7的sgRNA可成功敲除PDE10A,且敲除效率高达31.4%;稳定敲除PDE10A的细胞株筛选成功,可导致2 bp缺失。结论PDE10A基因CRISPR/cas9敲除系统构建成功。

摘要：目的观察cas9 RNP技术制备B2M和PD-1双基因敲除的人原代T淋巴细胞(以下简称T细胞)的效率。方法设计单向导RNA(sgRNA)后克隆至载体质粒,经转染HEK293T细胞后筛选出高效率的sgRNA;先后构建B2M及PD-1单基因敲除及同时敲除双基因的T细胞,分别通过Sanger测序、TA克隆及流式细胞术等方法验证编辑效率。结果成功构建包含sgRNA的载体质粒并经初筛获得高效率的B2M sgRNA1及PD-1 sgRNA1;在T细胞中验证B2M和PD-1单基因敲除效率均高达90%;构建双基因敲除T细胞后经验证基因层面的编辑效率高达90%,B2M及PD-1蛋白的表达下调率分别达86%、89%。结论利用cas9 RNP技术可制备B2M和PD-1高效率双基因敲除的T细胞。

摘要：目的通过CRISPR/cas9技术获得肌肉特异性表达cas9蛋白小鼠胚胎,为建立肌肉特异表达cas9小鼠动物模型奠定基础。方法设计小鼠Rosa26位点sgRNA并通过体外酶切验证活性,同时使用同源重组构建肌肉特异性同源打靶载体;通过显微注射将Rosa26sgRNA与cas9蛋白注射到小鼠胚胎,通过PCR及测序检测胚胎的编辑情况,同时移植到假孕母鼠体内,待其生产;将同源打靶载体与Rosa26sgRNA和cas9一起注射到小鼠胚胎,通过PCR检测整合情况。结果体外酶切实验表明,体外转录的sgRNA与cas9蛋白联合可对靶位点产生编辑作用;成功构建了肌肉特异性同源打靶载体Donor-SP-px459;通过原核注射获得Rosa26基因编辑胚胎,经移植获得Rosa26基因编辑小鼠;注射同源打靶载体后,成功获得肌肉特异表达cas9蛋白的基因打靶小鼠胚胎。结论利用CRISPR/cas9技术,成功获得Rosa26基因编辑胚胎和小鼠,并获得了肌肉特异性表达cas9蛋白小鼠胚胎,为利用基因打靶构建肌肉特异表达cas9的小鼠动物模型奠定基础。

摘要：CRISPR-cas(clustered regularly interspaced short palindromic repeats-CRISPR-associated proteins)系统为细菌与古生菌中抵御外源病毒或质粒DNA入侵的获得性免疫系统。该系统在crRNA的指导下,使核酸酶cas识别并降解外源DNA。其中,Ⅱ型CRISPR-cas系统最为简单,仅包括一个核酸酶cas9与tracrRNA:crRNA二聚体便可完成其生物功能。基于CRISPR-cas9的基因组编辑技术的核心为将tracrRNA:crRNA设计为引导RNA,在引导RNA的指导下cas9定位于特定DNA序列上,进行DNA双链切割,实现基因组的定向编辑。CRISPR-cas9系统以设计操纵简便、编辑高效与通用性广等优势成为新一代基因组编辑技术,为基因组定向改造调控与应用等带来突破性革命。从CRISPR-cas9介导的基因组编辑技术的发展与应用等方面综述其最新研究进展,并着重介绍该技术的关键影响因素,为相关研究者提供参考。

摘要：目的探讨CRISPR-cas9基因编辑技术在乙肝病毒感染治疗中的应用。方法构建CBFβ表达载体,根据从Hep G2细胞中提取的RNA,反转得到c DNA,设计CBFβ引物扩增目的基因,连接,转化,挑取阳性克隆,通过PCR鉴定及酶切鉴定,测序进一步鉴定。结果获得了稳定敲除CBFβ的Hep G2细胞系及稳定表达的CBFβ真核表达载体。结论 CRISPR-cas9技术可有效清除感染细胞内基因组,对于乙肝的治疗意义重大,值得推广。

摘要：目的为研究胰岛素受体底物1(Irs1)基因与代谢病之间的关系,我们利用CRISPR/cas9系统敲除大鼠Irs1基因,为研究代谢病提供基因敲除大鼠。方法针对Irs1第一外显子,设计CRISPR/cas9作用靶点,构建sgRNA表达质粒。利用T7 RNA聚合酶体外转录sgRNA和cas9。将cas9 mRNA和sgRNA混合物注射入SD大鼠的受精卵中,实现靶基因敲除。用T7EN1实验初步检测靶基因的修饰情况,再经过测序分析确定突变。结果获得了5个在Irs1基因突变的首建鼠,突变效率为83%。结论得到了稳定遗传的Irs1基因敲除大鼠。

摘要：CRISPR/cas系统为细菌与古细菌中抵御外源病毒和质粒DNA入侵的获得性免疫机制系统。作为一种新型的基因组编辑技术,具有设计简单、特异性强、效率高等优点,为基因组定向改造调控和应用带来了突破性的革命。就CRISPR/cas系统的研究背景、存在类型以及TypeⅡ和TypeⅢCRISPR系统的基本作用原理和新的研究突破做了较为详尽的介绍,以便为读者和相关领域的研究者提供参考。

摘要：随着转基因技术的发展,出现了多种对基因组进行定点编辑的新技术。本文介绍了常用的植物基因组定点编辑技术的基本原理,特别对新近发展起来的CRISPR/cas系统的原理、组成及各元件的作用等进行了综述,比较了CRISPR/cas系统与ZFN、TALEN等常用定点编辑技术的异同。文中列举了利用CRISPR/cas系统对几种单子叶和双子叶植物进行基因组定点编辑的案例,认为通过CRISPR/cas系统对植物基因组进行定点编辑是可行的,特别是由于嵌合sg RNA的成功设计,使得应用CRISPR/cas系统更加简单方便。研究人员正在努力降低CRISPR/cas系统的毒性和脱靶率,拓宽该技术的应用空间。

摘要：目的对CRISPR相关蛋白cas3、cas6及cas9进行表达纯化,并测定其活性。方法在体外构建带有目的基因的质粒,导入大肠杆菌表达系统,通过大肠杆菌的过表达,裂解并提取蛋白,利用His标签,可将目的蛋白纯化出来;通过3种cas蛋白对不同核酸的切割,分别设计3种核酸底物,再通过聚丙烯酰胺凝胶电泳,最终确定cas蛋白的活性。结果成功表达并纯化得到cas3、cas6及cas93种蛋白,并根据其蛋白特性,与相应的核酸底物进行孵育,在电泳后通过凝胶成像,可观察到3种蛋白均具有活性。结论表达纯化的cas3、cas6及cas9具有生物学功能,为其功能机制研究奠定了基础。