摘要：【目的】cas9tx是cas9的变体,能够显著降低基因编辑过程中染色体易位,大幅提升基因编辑的安全性。研究cas9tx替换cas9实现基因定点敲入的可行性。【方法】首先,利用His标签蛋白纯化技术制备cas9tx蛋白,并在细胞水平上通过绘制EC50和核酸酶裂解动力学曲线等进行功能验证。其次,以RNP和dsDNA混合物电转的方式编辑体外激活的T细胞,流式检测定点敲入的效率。最后,探讨了供体模板进行稳定性修饰提升定点敲入效率的可行性。【结果】制备的cas9tx在T细胞TRAC基因的A、R和S靶点的敲除效率分别为71.8%、81.0%和79.9%,具有与cas9相当的基因敲除效率。在TRAC 1号外显子分别设计的dsDNA供体模板(2A-GFP编码序列)和ssDNA供体模板(+GTC bp),发现cas9tx RNP定点敲入两种模板的效率均显著低于cas9RNP。通过DNA修饰制备防TREX2核酸外切酶降解的供体模板,不能提升cas9txRNP定点敲入的效率。【结论】cas9tx RNP在TRAC三个靶点的基因敲除方面可以替代cas9RNP使用,但定点整合外源基因的效率约为cas9RNP的一半。为cas9tx应用于基因定点敲入提供了重要参考。