摘要：背景:到目前为止,国内外对caspase 3抑制剂的研发大都集中在肽类或非肽类化合物的合成和发现上,而利用RNAi干扰技术直接沉默caspase 3基因,在基因水平抑制软骨细胞凋亡还未见报道。目的:利用慢病毒载体,把caspase 3 siRNA转入软骨细胞,使其caspase 3基因沉默,相对阻断凋亡效应的联级反应,期望达到抵抗软骨细胞凋亡的目的。设计、时间及地点:单一样本观察,于2008-06/2009-06在暨南大学医学院附属广州市红十字会医院,广州市创伤外科研究所完成。材料:软骨细胞从SPF级SD大鼠关节中提取,caspase 3 siRNA慢病毒载体为实验构建。方法:构建大鼠pSIH1-H1-copGFP-caspase 3 siRNA表达质粒,使用慢病毒包装系统,在293TN细胞中进行包装生产含caspase 3 siRNA的慢病毒颗粒,然后转导(transduce)入大鼠软骨细胞。主要观察指标:实时荧光定量-聚合酶链反应和Westernblot检测转导后软骨细胞caspase 3基因沉默情况,再用肿瘤坏死因子α诱导软骨细胞凋亡,流式细胞技术AnnexinV/PI检测软骨细胞凋亡情况。结果:caspase 3 siRNA能顺利转入软骨细胞,转导率达90%;实时荧光定量-聚合酶链反应检测软骨细胞中caspase 3mRNA的表达量,实验组低于与对照组差异有显著性(P<0.01);Western blot检测软骨细胞的caspase 3蛋白表达量,实验组低于与对照组差异有显著性意义(P<0.01);在使用肿瘤坏死因子α诱导软骨细胞凋亡时,caspase 3 siRNA转导组抑制细胞凋亡的能力是对照组的7倍。结论:利用慢病毒载体把caspase 3 siRNA转入软骨细胞,使软骨细胞的caspase 3基因沉默,可以达到相对拮抗软骨细胞凋亡的目的。

摘要：DrIce基因在果蝇的细胞调亡代谢途径中起着重要作用。采用tblastn程序将DrICE在家蚕EST数据库中进行同源性检索,检索到的EST序列进行电子延伸,根据延伸结果设计引物,用RT-PCR检测和克隆测序验证,成功地克隆到家蚕第二种caspase基因的全长cDNA(GenBank登录号为:AY885228)。克隆的cDNA长1410bp,ORF长825bp,编码275个氨基酸残基,预测分子量为31.8kD,等电点为6.15,基因名定为BmIce。将BmIce的cD-NA与家蚕基因组序列进行比对,结果表明该基因具有6个外显子,外显子/内含子边界处均符合GT-AG规则。BmICE在氨基酸水平上与果蝇DrICE、线虫的CED-3的一致性分别为34%和29%,在第169个氨基酸残基处具有QACRG的五肽活性位点,该活性位点是caspase家族的典型结构。与果蝇caspase家族聚类分析中,BmICE与果蝇中具有短的N端结构域的DrICE、DCP-1及DECAY聚为一类,根据其结构分析和聚类分析,推测家蚕BmIce基因可能参与细胞凋亡的执行作用。

摘要：【目的】细胞凋亡是真核生物中保守的细胞程序化死亡,由蛋白酶caspase介导。Strica是果蝇Drosophila中一个特殊的caspase,至今未有其商品化抗体且生化功能未知。本研究旨在通过克隆、原核表达纯化果蝇Strica蛋白并制备其多克隆抗体来初步研究其功能。【方法】根据果蝇Strica的基因序列构建原核表达载体并转化至大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)感受态细胞,表达Strica蛋白;将表达纯化后的Strica蛋白免疫家兔制备多克隆抗体;通过间接ELISA和Western blot分别测定抗体效价和灵敏度;利用前期构建的过表达载体pAc5-V5-Strica进行转染果蝇S2细胞,设计合成siRNA进行RNAi验证该抗体的特异性;利用该抗体通过免疫荧光实验检测Strica在果蝇S2细胞中的亚细胞定位;利用该抗体通过Western blot实验探究放线菌酮(10μg/mL)处理后果蝇S2细胞中Strica蛋白的激活状态。【结果】获得了果蝇Strica重组蛋白;ELISA检测Strica抗体的效价大于1∶25 600;Western blot鉴定该抗体在1∶10 000的稀释度下能与重组蛋白反应;该抗体可以检测到S2细胞中过表达以及内源性Strica蛋白;Strica蛋白在S2细胞质中呈现散点分布;放线菌酮介导Strica蛋白的切割激活。【结论】成功制备了兔抗果蝇Strica多克隆抗体。Strica响应凋亡刺激物放线菌酮激活,推测Strica参与果蝇的细胞凋亡过程。本研究为进一步深入研究Strica的功能奠定了实验基础。

摘要：目的 探讨EV71病毒2B基因对EV71病毒诱导细胞凋亡的影响.方法 设计、合成靶向EV71病毒2B基因的siRNA,PCR验证干扰效果,筛选最优siRNA浓度;易感非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)转染后接种EV71病毒,通过普通显微镜下细胞形态观察、细胞存活率测定、培养上清病毒滴度测定验证2B基因siRNA对病毒感染的抑制作用;通过流式细胞术检测细胞周期变化;通过Western blotting检测caspase 3等凋亡蛋白,探讨凋亡通路上关键蛋白的改变.结果 靶向EV71病毒2B基因的siRNA在100 nM浓度下具有最优的基因沉默效果,EV71病毒感染前经转染处理的细胞存活率增高、上清病毒滴度降低、细胞周期阻滞减轻、凋亡蛋白caspase 3激活减少(均P<0.05).结论 EV71病毒2B基因siRNA通过caspase 3信号通路抑制病毒诱导的细胞凋亡.

摘要：开发了一条合成天然产物Uncinine的新方法,基于此设计合成了一系列新型的丁烯内酯衍生物.通过噻唑蓝(MTT)法评价了目标化合物对胃癌细胞的增殖抑制活性,分析了其构效关系.其中,3-吗啉甲基-4-(4-叔丁基苯基)亚基丁烯内酯(9l)对MGC803的IC50为2.9μmol/L,对胃癌细胞MGC803、HGC27以及SGC7901具有明显的选择性增殖抑制作用,而对正常的胃粘膜上皮细胞GES1具有较小的毒性.初步的作用机制研究表明,化合物9l诱导胃癌细胞MGC803凋亡依赖caspase 9/3激活.

摘要：目的探讨凋亡相关基因caspase3（CASP3）、caspase9（CASP9）单核苷酸多态性与胃癌遗传易感性的关系。方法采用以自然人群为基础的病例对照研究设计，对278例胃癌患者和以同年龄（±5岁）、同性别、同居住地匹配为原则获得的278名对照进行研究。CASP3rs12108497和CASP9rs4646018多态位点的基因分型采用聚合酶链反应一限制性片段长度多态性的方法分析。非条件Logistic回归分析计算基因多态与胃癌风险的相关性。结果携带CASP3rs12108497TC、CC基因型者患胃癌的风险较TT基因型者分别增加45％（OR—1．45，95％CI：1．01～2．07）和117％（OR=2．17，95％CI：1．15～4．08）。未发现CASP9rs4646018基因多态与胃癌发病风险间存在显著关联。多基因模型显示携带1个或2个风险基因型的个体胃癌易感性增高（0R=1．60，95％CI：1．12～2．30）。分层分析表明，携带1个或2个风险基因型的个体罹患胃癌的危险度在男性个体（OR=1．62，95％CI：1．05～2．49）、吸烟者（OR=1．87，95％CI：1．12～3．12）、饮酒者（OR=1．92，95％CI：1．02～3．65）和无肿瘤家族史者（OR—1．78，95％CI：1．18～2．68）中尤为明显。结论CASP3rs12108497多态性会增加胃癌的发病风险。CASP9rs4646018多态性与胃癌发病风险无关。

摘要：目的:观察白藜芦醇对A549肺腺癌细胞生长的影响并对促凋亡机制进行初步研究。方法:使用MTT方法观察不同浓度与作用时间的白藜芦醇对A549细胞增殖的影响,采取流式细胞技术观察白藜芦醇对A549细胞促凋亡情况与细胞周期的影响,选用Western-blot技术观察不同浓度白藜芦醇作用下A549细胞凋亡相关蛋白p53、Bcl-2家族及caspase的变化。结果:白藜芦醇对A549细胞增殖的抑制呈浓度/时间双重依赖,作用24 h IC50值是29.3μM,这种抑制作用有凋亡机制的参与。A549细胞发生了S期阻滞,凋亡相关蛋白中p53浓度增加,Bcl-2家族蛋白中促凋亡蛋白/抗凋亡蛋白比值上调,caspase-3、-9发生剪切。结论:白藜芦醇能通过促凋亡作用抑制A549肺腺癌细胞的增殖,诱导出现S期细胞阻滞,与细胞凋亡线粒体途径相关的p53、Bcl-2家族蛋白、caspase-3、-9等多种凋亡相关因子也参与促凋亡作用中,白藜芦醇对A549的促凋亡效应可能是一个多靶点多层次的作用机制。

摘要：骨肉瘤化疗的整体有效率仍大约在60%,主要原因是化疗药毒副作用和肿瘤细胞耐药问题。其他问题包括二线化疗药的缺少、化疗风险评估、化疗新方案等问题也仍待解答。天然产物作为自然界中由活生物产生的具有药理学或生物学活性的化学物质,可被用于药学上的药物研发与药物设计，其优势在于细胞毒性小。

摘要：目的：探讨胎儿中枢神经组织细胞凋亡与神经管缺陷（NTDs）发生的关系。方法采用病例对照研究设计，收集产前诊断引产或死胎死产 NTDs 胎儿为 NTDs 组；非缺陷引产胎儿为对照组。通过病理解剖，获得 NTDs 组与对照组脊髓组织标本23和21例，NTDs 组和对照组脑组织标本30和20例。应用 Western blot 法检测脊髓和脑组织中细胞凋亡关键酶 caspase 3、caspase 8及 caspase 9蛋白及其裂解产物表达水平。结果 NTDs 组和对照组脊髓组织或脑组织中均可检测到 caspase 蛋白条带，NTDs 组中枢神经组织 caspase 的裂解激活产物cleaved caspase 蛋白条带较明显。NTDs 组脊髓组织和脑组织中 cleaved caspase 3（17 kD）和 cleaved caspase 8（18 kD）的表达 IOD 水平略高于对照组，但差异无统计学意义；两组 cleaved caspase 9（37／35 kD）比较，差异无统计学意义。无脑胎儿脊髓组织和脑膨出胎儿脑组织中 cleaved caspase 3（17 kD）表达水平高于对照组；无脑胎儿脊髓组织中 cleaved caspase 8（18 kD）及脊柱裂胎儿脑组织中 cleaved caspase 8（43／41 kD）表达水平高于对照组；差异均有统计学意义。结论人胚胎中枢神经组织细胞过度凋亡可能与 NTDs 发生有关，NTDs 发生过程中细胞过度凋亡可能通过 caspase 8裂解激活诱导的外源性凋亡途径。