摘要：荧光共振能量转移技术(fluorescence resonance energy transfer,FRET)作为一种经典的荧光检测技术,已经广泛运用于生物科学研究中,开发了一系列基于FRET技术的荧光检测探针。半胱氨酸蛋白酶家族(cysteine aspartic acid specific protease,caspase)在细胞凋亡通路中发挥着十分重要的作用,尤其是位于死亡受体介导的凋亡通路起始位置的caspase-8,它的激活能引发后续的一系列caspase酶原的激活并引起细胞的凋亡。因此,caspase-8活性的检测在细胞凋亡检测中具有非常重要的意义。本文基于蛋白酶类FRET荧光探针原理设计了一个能检测活细胞内caspase-8活性变化的荧光探针,并且在流式细胞仪上利用FRET技术检测了细胞凋亡诱导剂特异性激活的caspase-8活性,从而证明了所构建的探针检测caspase-8活性的有效性和特异性。结果表明,所设计的探针能够特异性地响应细胞凋亡诱导中引起细胞内caspase-8酶活性的变化,并且能够利用流式细胞技术得以快速定量检测。本研究为在活细胞中检测caspase-8活性提供了一种更加方便快捷的检测方法。

摘要：目的:设计并构建针对人caspase-8基因mRNA的siRNA表达载体,观察其对转染细胞中的caspase-8的抑制作用。方法:化学合成用于产生针对caspase-8的发夹状的RNA的寡核苷酸,将合成的寡核苷酸链退火形成双链,连接入经HindIII和BglII双酶切后的pSUPER真核表达载体。对重组质粒进行酶切分析和测序鉴定。通过脂质体介导,把重组质粒瞬时转染入HeLa细胞,RT-PCR、间接免疫荧光检测其对mRNA和蛋白表达的干涉效果。结果:构建了针对人caspase-8基因的RNA干涉真核表达载体pSUPER-C1和pSU-PER-C2,并在人HeLa细胞中有效发挥了对caspase-8基因的干涉作用,而且pSUPER-C1对于caspase-8基因的抑制作用要优于pSUPER-C2。结论:成功地构建了针对人caspase-8基因的siRNA载体,转染HeLa细胞后可抑制caspase-8基因的表达。

摘要：目的:研究Bcl-2、Bax和caspase-8mRNA在大运动量大鼠心肌组织中表达变化及壳寡糖的调节作用。方法:用健康3月龄SPF级SD雄性大鼠48只,按体重完全随机设计分为正常对照组、运动组、阳性对照组和壳寡糖组。运动组、阳性对照组和壳寡糖组进行为期6周的跑台训练。训练结束24h后处死大鼠,迅速取出心脏,运用荧光实时定量PCR技术检测心肌组织Bcl-2、Bax和caspase-8mRNA表达水平;同时利用透射电镜观察大鼠心肌组织形态结构。结果:运动组Bcl-2mRNA的表达水平显著降低,而Bax和caspase-8 mRNA的表达水平显著增高,与其他3组比较呈显著差异(P0.05)。电镜观察,运动组心肌组织可见凋亡细胞,心肌细胞损伤明显,肌原纤维模糊、断裂甚至坏死,线粒体肿胀等形态学改变。壳寡糖组与阳性对照组和正常对照组比较心肌组织形态结构无明显变化。结论:大运动量训练能导致大鼠心肌组织的基因表达异常,造成心肌组织损伤。壳寡糖可调节大运动量训练大鼠心肌组织Bcl-2、Bax和caspase-8mRNA表达水平,维持心肌组织的正常形态结构。

摘要：为研究环境压力对金鱼细胞凋亡外在途径的影响,设计特异性引物扩增caspase-8基因片段(编码第305—763位氨基酸),然后进行原核表达,并通过动物免疫实验制备caspase-8多克隆抗体,检测其效价、金鱼不同组织表达水平和相关蛋白互作.结果表明:制备的caspase-8多克隆抗体与抗原结合的最大稀释倍数为1∶256 000,显示出良好的免疫原性;caspase-8在金鱼不同组织中有不同程度表达;caspase-8与E3泛素连接酶cullin3存在相互作用.综上,制备的caspase-8多克隆抗体有望应用于金鱼细胞凋亡蛋白caspase-8表达水平及相关蛋白互作的研究中.

摘要：目的：探讨20（S）-人参皂苷Rg3（SPG-Rg3）对人乳腺癌MCF-7细胞的诱导凋亡作用及其可能机制。方法：人乳腺癌细胞MCF-7细胞株分为SPG-Rg3实验组及空白对照组。采用MTT法观察SPG-Rg3对MCF-7细胞生长的抑制作用，并计算出IC50，依据IC50值确定SPG-Rg3的有效浓度；流式细胞术检测SPG-Rg3作用后MCF-7细胞周期的变化；AO／EB双染从形态学上观察SPG-Rg3对MCF-7细胞凋亡的作用；免疫细胞化学染色和RT-PCR技术分别从蛋白水平和分子水平上检测SPG-Rg3对MCF-7细胞的诱导凋亡作用及其与caspase-8基因的关系。结果：SPG-Rg3 IC50为（155．70±0．71）mg
83;L^-1,当SPG-Rg3浓度在37．5～600．0mg
83;L^-1时，MCF-7细胞的生长抑制率随SPG-Rg3浓度的增加而增大，与对照组比较，细胞增殖受到明显抑制（P〈0．05）；MCF-7细胞的生长周期也发生变化，S期细胞数增加，明显高于对照组（P〈0．01），G2／M期细胞数则明显少于对照组（P〈0．01）；并且在G1峰前出现明显的凋亡峰，凋亡细胞数增加。形态学上观察到SPG-Rg3（150mg
83;L^-1）实验组细胞大部分核着黄色荧光或橘红色荧光，形态呈固缩状、圆珠状或新月形，呈现明显的凋亡改变；caspase-8免疫细胞化学染色可见，对照组MCF-7细胞caspase-8蛋白不表达，SPG-Rg3实验组则呈强表达，两组细胞HSCORE得分为1．894±0．027及2．869±0．043，两组比较差异有显著性（P〈0．01）；提取细胞mRNA并设计caspase-8引物进行RT-PCR，SPG-Rg3实验组细胞caspase-8大量表达，对照组细胞无表达。结论：SPG-Rg3能诱导乳腺癌MCF-7细胞发生凋亡，其机制可能与其活化caspase-8作用有关。

摘要：目的研究UVA对HaCaT细胞肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（tumour necrosis factor related apoptosis inducing ligand，TRAIL）表达的影响；复制UVA诱导的HaCaT细胞凋亡模型，探究TRAIL在UVA诱导的HaCaT细胞凋亡中的作用及扇贝多肽（Polypeptide from Chlamys farreri，PCF）对UVA诱导的TRAIL凋亡通路的影响。方法实验设计分为5组：对照组、UVA模型组、UVA＋5．69mmol
83;L^-1PCF组、UVA＋2．84mmol
83;L^-1PCF组、UVA＋1．42mmol
83;L^-1PCF组。Real-Time PCR检测TRAIL mRNA表达；蛋白质印迹法检测TRAIL蛋白表达及caspase-8活性；琼脂糖凝胶电泳分析TRAIL中和性抗体对UVA诱导的HaCaT细胞凋亡的影响。结果8J
83;cm^-2UVA照射HaCaT细胞后TRAIL mRNA及蛋白表达增加，与对照组相比差异有显著性（P〈0．01）；TRAIL中和性抗体对UVA诱导的HaCaT细胞凋亡有抑制作用；1．42～5．69mmol
83;L^-1剂量范围内的PCF可剂量依赖性抑制UVA引起的HaCaT细胞TRAIL mRNA及蛋白表达（P〈0．05，P〈0．01）；PCF对UVA引起的HaCaT细胞caspase-8的活化有抑制作用，且呈量效关系。结论UVA可增强HaCaT细胞TRAIL表达；TRAIL参与了UVA诱导的HaCaT细胞凋亡；PCF对UVA诱导的HaCaT细胞TRAIL表达有抑制作用，也可减弱UVA诱导的caspase-8活化，以其抗氧化活性抑制TRAIL凋亡通路而发挥抗凋亡作用。

摘要：caspase-8能通过自身活化启动凋亡，并调节效应型caspase诱导凋亡发生。阻滞caspase-8表达可抑制caspase途径所致凋亡。TNF-α通过caspase-8途径可诱导肝细胞凋亡。故本研究设计合成了针对caspase-8 mRNA的shRNA真核表达载体，导入TNF-α所致的小鼠肝细胞损伤模型，研究shRNA对caspase-8基因转录后沉默的有效性。

摘要：目的:创伤导致的失血性休克是临床上常见的导致死亡的原因之一,传统的快速扩容措施会导致缺血-再灌注损伤,诱发炎症反应和组织细胞的凋亡坏死;新型气体信号分子硫化氢(H2S)具有抗炎、促进心血管增生等多种生理保护功能,在此实验中我们探索了新型气体信号分子硫化氢(H2S)对出血性休克大鼠心肌的保护作用。方法:复制雄性SD大鼠出血性休克模型:复制大鼠腹中正切口造成创伤模型,然后经右侧股动脉插管放血,造成失血性休克,右侧股静脉建立液体通道准备复苏,给药组大鼠经腹腔给予NaHS(28μmol/kg),经左侧股动脉插管至左心室监测大鼠血流动力学的影响;取大鼠复苏后2 h静脉血,测量血清肌酸激酶(CK)及乳酸脱氢酶(LDH)水平,比较各组心肌酶改变。以蛋白印记法观察大鼠心肌组织凋亡相关因子Bcl-2、Bax、与caspase-8的表达变化。结果:外源性H2S对创伤性休克大鼠的血流动力学指标有不同程度的改善,保护了创伤休克导致的心肌细胞的损伤,并上调了大鼠心肌组织中抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,下调了促凋亡蛋白Bax及caspase-8的表达。结论:外源性硫化氢可能通过抑制凋亡途径来保护创伤性休克导致大鼠的心肌组织的损伤,从而起到保护作用。