摘要：【目的】验证鸡circSFMBT2的环形结构,探究其表达规律及功能。【方法】以麒麟鸡和df-1细胞为研究对象,根据反向剪切位点序列特征设计引物,通过PCR和测序验证circSFMBT2的环形结构。通过RNase R和反转录试验分析circSFMBT2的基本特性,利用qRT-PCR探究不同组织、不同时期circSFMBT2的表达水平。通过构建过表达载体,结合qRT-PCR、Edu和CCK-8等试验,探究circSFMBT2对鸡df-1细胞增殖的影响。【结果】鸡circSFMBT2全长827 nt,由SFMBT2基因外显子12~18环化形成。RNase R耐受性试验表明,circSFMBT2不易被RNase R降解,随机引物对circSFMBT2的反转录效率是Oligo-d(T)18引物的8倍。组织表达谱表明,circSFMBT2在麒麟鸡14胚龄以及1周龄的肝脏和脾脏中高表达、在胸肌和腿肌中低表达。circSFMBT2在胸肌和腿肌的时序表达谱表明,circSFMBT2在胚胎时期表达量较高,出生后表达量迅速下降。在df-1细胞中circSFMBT2过表达48 h后,增殖标记基因PCNA和CCND1的表达量分别较对照组上调85%和92%。E d u和C C K-8细胞增殖试验表明,鸡c i r c S F M B T 2可以促进细胞增殖进程。【结论】circSFMBT2是鸡SFMBT2基因的一个环状转录本,可以促进df-1细胞的增殖,研究结果为深入探究鸡circSFMBT2的生物学功能和作用机制奠定了基础。

摘要：为了研究线粒体相关基因精氨酸酶2(arginase-2,ARG2)在J亚群禽白血病病毒(J subgroup leukosis virus,ALV-J)感染中的作用,试验采用qRT-PCR方法分别检测感染ALV-J后试验组鸡不同器官和df-1细胞中ARG2基因的表达情况,分析ARG2基因和ALV-J感染之间是否有联系;设计ARG2基因的过表达载体(过表达ARG2组)和干扰片段(干扰ARG2组)转染df-1细胞,并以pcDNA3.1或Si-NC为对照,采用qRT-PCR方法检测ARG2基因的过表达和干扰效率;采用qRT-PCR、Western-blot和间接免疫荧光试验检测过表达或干扰ARG2基因后感染ALV-J的df-1细胞中gp85基因及Env蛋白表达情况,从而综合分析ARG2基因对ALV-J复制的影响。结果表明:与对照组相比,试验组鸡的脾脏、法氏囊中ARG2基因相对表达量极显著降低(P0.05或P0.05或P<0.05),并选择干扰片段SI-ARG2-001进行后续试验。过表达ARG2基因后,与对照组相比,过表达ARG2组第12,24小时的gp85基因相对表达量显著或极显著升高(P<0.05或P<0.01),Env蛋白表达量显著上调(P<0.05),Env免疫荧光信号强度增强;干扰ARG2基因后,与对照组相比,干扰ARG2组第6,12,48小时的gp85基因相对表达量显著或极显著降低(P<0.05或P<0.01),Env蛋白表达量显著下调(P<0.05),Env免疫荧光信号强度减弱。说明ARG2基因可以促进ALV-J在df-1细胞中的复制。

摘要：【目的】制备红嘴鸥Toll样受体7(Toll-like receptor 7,TLR7)蛋白多克隆抗体,分析红嘴鸥TLR7蛋白在df-1细胞中的表达特征,为深入了解红嘴鸥TLR7蛋白功能及作用机制提供材料。【方法】设计引物扩增红嘴鸥TLR 7基因CDS区,并构建其原核表达载体与真核表达载体。将重组原核表达质粒pET32a-TLR7转化大肠杆菌Transetta(DE3)感受态细胞进行重组蛋白体外诱导表达,并对其诱导温度、诱导时间和IPTG浓度进行优化筛选。选用新西兰大白兔制备多克隆抗体,采用间接ELISA法检测血清抗体价效,利用Western blotting鉴定抗体特异性。将真核表达质粒pcDNA3.1-TLR7转染至df-1细胞中过表达,利用间接免疫荧光技术检测红嘴鸥TLR7蛋白在转染df-1细胞后不同时间点的表达特征。【结果】红嘴鸥TLR 7基因CDS区长约1182 bp,双酶切结果显示出2组大小不同的2条片段,分别为5900、1182 bp(原核表达载体)和5428和1182 bp(真核表达载体),测序后表明原核表达载体与真核表达载体构建成功。体外诱导温度为30℃、IPTG终浓度为1.0 mmol/L时培养5 h得到以包涵体形式大量表达的重组蛋白,蛋白大小为63 ku。间接ELISA法检测抗血清效价为1∶256000以上。Western blotting检测结果表明,制备的多克隆抗体具有较好的特异性。间接免疫荧光结果显示,转染df-1细胞2 h后即可观察到绿色荧光,随着时间增加绿色荧光密度逐渐增加,且绿色荧光大部分聚集在细胞核及周围,少部分散布在细胞质中。【结论】原核表达的红嘴鸥TLR7蛋白具有良好的免疫原性,制备的多克隆抗体具有较高的反应性和特异性,TLR7蛋白可在df-1细胞中成功表达。

摘要：J亚群禽白血病病毒(ALV-J)是一种严重危害养禽业的肿瘤疾病之一,因目前尚无可供广泛使用的有效疫苗和特效药,防控主要依靠种群净化。本试验以ALV-J原型毒株的gp37基因序列为参照,设计荧光引物,成功建立了特异性较强的ALV-J荧光定量PCR检测方法。随后,将ALV-J病毒液与黄芪提取液先后或同时作用于df-1细胞,培养72 h后,提取细胞总RNA,用建立的荧光定量PCR方法检测病毒对照组与直接灭活组、预防组、治疗组之间gp37基因表达量的差异,以此探索黄芪对gp37基因转录的影响。结果显示,病毒对照组与直接灭活组、预防组、治疗组的gp37基因表达量均有显著差异(P<0.05),其中预防组的gp37基因表达量与病毒对照组差异最大,表明黄芪能明显下调gp37基因的表达。因此,黄芪可能对J亚型禽白血病的防治有一定作用。

摘要：根据高效培养鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)时对病毒滴度检测的需要,本文针对IBDV VP4基因的保守序列设计并合成了一对引物,以所构建的重组质粒作为阳性标准品,建立了检测IBDV核酸载量的SYBR Green I荧光定量实时RT-PCR(qRT-PCR)方法,结果表明,其Ct值与标准品模板在4.0315;101～109拷贝/μL范围内呈良好的线性关系,对IBDV核酸的最低检出量为40拷贝/μL,灵敏度是常规RT-PCR检测方法的1 000倍;该方法不与其它禽源病毒发生交叉反应,批内变异系数小于0.5%。应用本方法对df-1细胞中IBDV的增殖滴度进行了测定,并与经典的TCID50测定方法进行了比较。结果显示两种方法测定的IBDV在微载体悬浮培养和方瓶静态培养条件下df-1细胞上的增殖曲线都具有一定的平行关系,且qRT-PCR方法比TCID50方法更加快速和敏感,更适合于对IBDV增殖滴度的实时快速测定。