摘要：目的利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建抗肌萎缩蛋白(dystrophin,dmd)基因第23号外显子点突变的dmd基因突变小鼠,分析并验证该小鼠在肌肉及免疫系统中的表型变化,为杜氏肌营养不良症等疾病提供评价模型。方法针对dmd基因23号外显子序列特征,设计合成小向导RNA(small guide RNA,sgRNA),将Cas9 mRNA、sgRNA片段和oligo donor DNA显微注射到C57BL/6J小鼠受精卵中,并将该受精卵移植至代孕鼠后出生获得F0代小鼠,F0代小鼠通过交配获得子代小鼠后,基因型鉴定筛选得到dmd基因阳性突变小鼠(命名为dmd^(Mu/+)小鼠)。选择3月龄和9月龄的雄性半合子dmd^(Mu/+)小鼠(命名为dmd^(Mu/Y)小鼠)和野生型C57BL/6J小鼠(作为对照)用于表型验证:称量记录活体小鼠体重,并通过悬挂实验检测小鼠肌张力,采集心脏和半腱肌,采用HE染色法观察组织病理学变化,进一步通过蛋白质印迹法检测9月龄小鼠肌肉组织内dmd蛋白的表达情况。利用脂多糖诱导建立dmd^(Mu/Y)小鼠急性炎症模型,采集小鼠颌下静脉血,采用流式细胞术检测外周血中性粒细胞和单核细胞比例变化。结果基因组测序和蛋白质印迹结果表明dmd基因点突变小鼠(即dmd^(Mu/+)小鼠)构建成功,dmd^(Mu/+)小鼠骨骼肌和心肌中未见dmd蛋白表达,与野生型C57BL/6J小鼠相比明显下降(P0.05)。结论成功构建了dmd基因突变小鼠模型,证实该基因具有维系肌肉组织正常形态和肌张力等重要功能,并初步发现该基因缺失会减少外周血液中性粒细胞比例,为后续研究杜氏肌营养不良症患者的免疫系统异变机制提供新的思路。

摘要：目的应用CRISPR/Cas9基因编辑技术,完成HEK293T细胞中dmd基因第51号外显子(exon51)高效的靶向敲除。方法设计靶向人dmd基因exon51 5'端及3'端的sgRNA并克隆至CRISPR/Cas9载体质粒PX459中,转染至HEK293T细胞后,提取基因组DNA并使用Surveyor法检测切割活性;使用目标外显子两端切割活性最高的sgRNA构建PX459-2sgRNA质粒,转染至HEK293T细胞后用PCR及T载体测序检测靶向外显子切除情况。结果50%的HEK293T细胞中dmd基因exon51被定向切除,编辑效率较高。结论建立使用CRISPR/Cas9单质粒敲除人dmd基因exon51的平台,为dmd及其他遗传病的基因治疗研究奠定实验基础。