摘要：目的构建一种新型10-23脱氧核酶（DZ）真核表达载体，并鉴定其在细胞内表达10—23DZ的能力以及10-23DZ抑制巨噬细胞TACO表达的效果。方法设计1条寡脱氧核糖核苷酸ODN—PSL，其序列包含鼠莫洛尼白血病病毒逆转录酶（MLV—RT）的引物结合序列、1个多克隆酶切位点（MCS）及1个逆转录终止信号序列。将ODN—PSL插入框架质粒pBUDCE4．1中启动子PCMV的下游，获取重组质粒pBUD—PSL。将MLV—RT的编码基因克隆至pBUD—PSL中另一启动子PEF-1a的下游，构建重组质粒pSDE01。将pSDE01转染入鼠巨噬细胞系RAW264．7细胞，采用RT—PCR方法鉴定细胞中MLV-RT的表达及其表达产物的逆转录酶活性。通过计算机软件模拟巨噬细胞TACOmRNA的二级结构，以此确定10-23DZ的作用靶位并设计一相应的10—23DZ——DZ1，将DZ1表达序列插入pSDE01中ODN—PSL的MCS中，获取重组表达载体pSDE01-DZ1。将pSDE01-DZ1转染入RAW264．7细胞，并设未转染对照组。转染后48h，采用PCR法和斑点杂交方法鉴定DZ1在细胞中的表达；并分别采用半定量RT-PCR和蛋白质印迹法检测TACO mPNA和蛋白的表达，各组实验均独立重复3次。结果限制性内切酶酶切及测序结果显示pSDE01构建成功，将其转染入RAW264．7细胞后检测到MLV-RT的表达，而且表达产物具有逆转录酶活性。pSDE01-DZ1转染入RAW264．7细胞后48h，PCR和斑点杂交方法均检测到DZ1的表达；半定量RT-PCR和蛋白质印迹检测结果显示，与未转染组相比，pSDE01-DZ1转染后48h巨噬细胞TACOmRNA表达水平下降了77．7％（0．193±0．008比0．864±0．005，P〈0．05），TACO蛋白表达量下降了73．3％（0．114±0．051比0．427±0．043，P〈0．05）。结论成功构建了一种操作简便的新型10—23DZ表达载体，所携带的特异性10-23DZ可在细胞内有效表达，并抑制相应靶基因的表达。

摘要：目的:观察针对HBV前C/C区的脱氧核酶(dnazyme)及锁核酸核酶(LNAzyme)对2.2.15细胞中HBsAg、HBeAg表达的抑制作用。方法:设计合成针对HBV前C/C区2031位点的10-23dnazyme、点硫代修饰的10-23dnazyme及LNAzyme。本实验设对照组和10-23dnazyme组、点硫代修饰的10-23dnazyme组、LNAzyme实验组。对照组包括空白对照组、单纯脂质体对照组、单纯10-23dnazyme对照组、无关10-23dnazyme对照组。观察在0.16、0.64、1.28、1.60及1.92μmol.L-1浓度下及12、24、36、48、60、72、84及96 h时间段对2.2.15细胞的HBsAg、HBeAg表达的抑制效应。结果:10-23dnazyme及LNAzyme作用于2.2.15细胞后,可明显抑制HBsAg、HBeAg的表达,且抑制率LNAzyme明显高于点硫代修饰的10-23dnazyme,而后者又明显高于未进行任何修饰的10-23dnazyme组。LNAzyme及点硫代修饰的10-23dnazyme对HBsAg的最高抑制率分别是(91.6±8.4)%和(78.4±2.0)%,对HBeAg的最高抑制率分别是(90.1±5.2)%和(76.4±4.8)%;在给药后12 h就表现出抑制效应,48 h达高峰,LNAzymes、点硫代修饰的10-23dnazyme有效抑制时间分别是为84及72 h。其对2.2.15细胞未见明显的细胞毒性作用。结论:10-23dnazyme及LNAzyme对2.2.15细胞具有明显的高效阻断HBV的HBsAg、HBeAg表达的作用,且LNAzyme优于dnazyme,是一类特异的高效的抗HBV治疗剂。

摘要：目的:观察10-23脱氧核酶对细菌β-内酰胺酶基因表达的抑制作用。方法:设计并合成针对细菌β-内酰胺酶SHV-5基因的10-23脱氧核酶、反义寡核苷酸和无关对照寡核苷酸,采用电穿孔法将其分别导入表达β-内酰胺酶SHV-5的大肠杆菌中,观察耐药菌在导入脱氧核酶后,在含β-内酰胺类抗菌素培养基中的生长活力及β-内酰胺酶表达量的变化。结果:10-23脱氧核酶导入表达blaSHV-5的大肠杆菌后,在含头孢他啶的培养基中大肠杆菌的生长活力明显低于反义寡核苷酸和无关对照dna转化的大肠杆菌,导入脱氧核酶的大肠杆菌其β-内酰胺酶表达量也明显低于反义寡核苷酸和无关对照dna转化的大肠杆菌。结论:10-23脱氧核酶能特异性地抑制细菌β-内酰胺酶基因表达。

摘要：目的:观察增殖细胞核抗原(PCNA)基因特异性的10-23脱氧核酶(dnaZYME)对人脐动脉平滑肌细胞(HUASMC)增殖的影响。方法:设计合成针对PCNA基因起始密码AUG的dnaZYME,应用脂质体转染法将其转人体外培养的HUASMC。检测dnaZYME干预HUASMC 2 D后[3H]-TDR的掺入量;通过四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法分析HUASMC的增殖;采用流式细胞仪检测细胞周期。结果:1．0 ΜMOL/L dnaZYME干预HUASMC 2 D后,[3H]-TDR 的掺入量低于对照组(P<0．05)。1．0ΜMOL/L的dnaZYME和反义寡聚核苷酸(ASODN)组处理2、3和5 D后,MTT比色吸光度值低于对照组(均P<0．01)。dnaZYME对细胞增殖的抑制呈剂量依赖性。细胞干预2 D后,dnaZYME、ASODN 和对照组的C0/G1期细胞的比率分别为73．8％、54．7％和41．1％。结论:针对PCNA的dnaZYME能有效抑制HUASMC 的体外增殖。

摘要：目的研究特异性脱氧核酶(10-23dnazyme)对喉癌真核细胞起始因子4E(eukaryotici nitiation factor-4E,eIF4E)基因mRNA的体外切割作用。方法设计合成针对原癌基因eIF4EmRNA编码区的1102、1289、1226位点的3个10-23dnazyme-eIF4E,用内切酶XhoI将含有eIF4E基因mRNA的pGEM-7zf+eIF4E质粒消化成线性。以此为模板体外转录出用[α-32P]UTP标记的靶eIF4E基因编码区mRNA。在37℃,pH7.5,Mg2+离子50mmol/L条件下,分别与3个10-23dnazyme-eIF4E(1μmol/L)混合进行切割反应,并比较不同Mg2+离子浓度下酶对靶mRNA的切割活性。反应产物在8%变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离并行放射自显影,应用凝胶成像分析仪评价酶的切割效率。结果在设定条件下,3个10-23dnazyme-eIF4E对eIF4E基因mRNA均有切割活性,且随着Mg2+浓度越高,酶的切割活性增强。结论3个10-23dnazyme-eIF4E能有效切割eIF4E基因编码区mRNA,且切割效率与Mg2+浓度有关。