摘要：基于绿色生物制造进行物质能量生产,有望减少对天然植被、耕地、石化等资源的依赖,而微生物细胞工厂是绿色生物制造过程的“芯片”。合成生物学为微生物细胞工厂的研究提供了重要的使能技术,但目前仍面临生命系统高度复杂、实验过程需要反复试错、实验通量较低等限制因素。自动化合成生物技术借助高通量、自动化和智能化的软硬件设施平台,基于标准化、模块化的生物元件库和合成生物工艺,可低成本、高通量、快速、多循环地完成海量工程试错性实验,加速特定性能人工细胞工厂的设计和优化,支撑相关研究和应用。本文主要针对细胞工厂“设计-构建-测试-学习”循环中最关键、最耗时的“构建”环节,对dna组装和底盘细胞操作自动化工艺和设施平台进行了总结,对自动化合成生物技术应用于生物合成基因簇挖掘、代谢通路优化和底盘细胞优化的最新进展进行了介绍。最后展望了微生物细胞工厂自动化构建面临的挑战和未来发展,讨论了包括非模式微生物在内的全流程自动化的发展趋势,而自动化装备的国产化自主研发将为此做出重要贡献。

摘要：为了获得既能高效扩增外源基因,又不产生复制型子代病毒的腺病毒载体,我们构建了一个Ⅲa基因缺失的单周期腺病毒载体。本研究在前期已构建的E3区携带绿色荧光蛋白GFP的人7型腺病毒载体pK-Ad7E3GFP基础上进行。首先设计引物扩增包含氨苄青霉素抗性基因和质粒复制起点的AMP-ORI片段,利用限制性内切酶Asc I将pK-Ad7E3GFP切割为29.1kb与7.7kb的大小片段,其中,7.7kb小片段与AMP-ORI片段组装,获得第一个中间质粒pA-Ad7E3GAscI;经重叠延伸PCR、酶切、dna组装等方法,将pA-Ad7E3GAscI上的Ⅲa基因进行删除,获得第二个中间质粒pA-AscDⅢa;经Pme I酶切的pA-AscDⅢa与上述29.1kb大片段经dna组装后,得到重组腺病毒质粒pK-Ad7DⅢaE3GFP。同时,构建携带Ⅲa基因的真核表达载体pTPL-Ⅲa,转染293细胞,经G418筛选构建细胞系293-Ⅲa。结果发现,经Pme I线性化的pK-Ad7DⅢaE3GFP质粒转染293-Ⅲa细胞,7d后可见荧光聚集,且逐渐增大,表明重组腺病毒Ad7DⅢaE3GFP拯救成功;提取病毒基因组进行PCR鉴定,结果与预期相符;细胞培养上清经负染后,在电镜下可见腺病毒典型的正二十面体形态,培养细胞中也可见病毒呈晶格排列;以上结果均表明Ad7DⅢaE3GFP拯救成功。本研究成功建立了Ⅲa基因缺失的单周期人7型腺病毒载体系统,为该载体的研究与应用奠定基础。

摘要：为了构建人5型腺病毒（HAdV-5）的感染性克隆,我们使用了Gibson dna组装技术。设计1对引物用于扩增质粒骨架（包含卡那霉素抗性基因和质粒的复制起点,KAN-ORI）,在引物的5’端添加HAdV-5基因组末端序列（约30NT）和Pac I位点,以携带卡那霉素抗性基因的pShuttle-CMV质粒为模板,PCR扩增得到KAN-ORI片段,该片段的两端均含有约30bp的HAdV-5基因组序列。将KAN-ORI片段与利用野毒扩增纯化的HAdV-5基因组混合,进行Gibson dna组装反应;反应产物直接转化***感受态细胞,涂布含卡那霉素的LB琼脂平板。挑取菌落,提取质粒,命名为pKAd5。限制性酶切鉴定的结果显示,所鉴定的质粒均含有完整的HAdV-5基因组。使用Pac I酶切线性化pKAd5,利用脂质体转染293细胞,转染4d后单层细胞出现病毒噬斑。拯救的病毒能够在HEp-2细胞扩增;电子显微镜观察呈现典型的腺病毒形态;提取病毒dna,酶切鉴定的结果与预期的HAdV-5基因组相同,证实HAdV-5得到成功拯救。上述研究结果说明使用Gibson dna组装技术构建HAdV-5感染性克隆简便易行,为其他dna病毒基因组的克隆提供了新思路。

摘要：合成生物学旨在应用工程学的研究思路及手段去设计或改造生物系统,是一个综合了科学与工程的拥有发展潜力的新兴学科,在生物医药、农业、能源、环保等方面发挥着巨大作用。dna组装技术是合成生物学中的关键技术,也是合成生物学快速发展的限制性技术。综述了众多dna组装技术的发展及其在合成生物学研究中的意义和应用。

摘要：dna设计合成是推动生命科学及其相关领域发展的关键共性底层技术。常规的遗传操作技术仅能对已有的dna序列进行有限的改造,而dna合成技术则可从头“书写”生命信息,从另一高度提升我们对生命体理解、预测和操控的能力。dna合成技术包括寡核苷酸合成技术、dna组装技术以及dna纠错技术。本文总结了以上关键技术的特点和发展趋势,经历超过60年的发展后,化学合成法仍然是当前寡核苷酸合成的主流方法,它被广泛应用于柱式及芯片dna合成仪,酶法dna合成技术则有望颠覆传统的dna化学合成方法;现有dna合成技术在合成能力和准确性上存在局限,难以直接准确合成基因长度的dna片段,分级的体外与体内组装技术的合理搭配,可将分段合成的寡核苷酸片段装配成长片段dna,达到基因长度甚至基因组长度dna序列的合成,它也因此成为长片段dna合成的关键;寡核苷酸的合成与组装过程都不可避免地引入错误,基于错配结合或错配切除的纠错技术在dna合成过程不同阶段的应用,不仅能提高dna合成的准确性,还可有效降低长片段dna合成的质控成本。近年来合成生物学等相关领域的迅猛发展,对dna合成相关技术提出了新的要求,正推动dna合成、组装与纠错相关技术向着高通量、自动化和集成化的方向不断改进和创新。

摘要：【目的】为齐整小核菌代谢工程研究建立高效的转录单元组装系统。【方法】通过应用Golden Gate技术,以mobius assembly为基础,分别设计并构建dna元件标准化接口改造、单转录单元组装、应用质粒(多转录单元)组装等功能的载体,从而形成一套完整的多转录单元组装系统。【结果】构建了2个用于dna元件标准化接口改造的Level 0载体,4个用于单转录单元组装的Level 1载体,4个用于应用质粒组装的Level 2载体和13个应用质粒组装的辅助质粒。然后应用此系统为齐整小核菌组装了若干经过标准化接口改造的dna元件质粒、单转录单元质粒和硬葡聚糖相关基因的功能分析质粒。所构建的最终应用质粒可以同时适用于齐整小核菌的根癌农杆菌介导转化法、电穿孔转化法和原生质体转化法。【结论】此质粒系统具有强大的dna设计、组装和容纳能力,为未来齐整小核菌代谢工程和功能基因组学研究提供了高效的质粒构建技术平台。

摘要：以同源重组、CRISPR等为代表的遗传操作技术是合成生物学的重要支撑技术。高效准确的遗传操作依赖于可准确定位编辑位点和实现序列改造的编辑序列(如引物序列、同源臂序列、sgRNA序列等)。由于遗传改造目标与遗传操作技术丰富多变,加之近年来基于生物铸造厂(BioFoundry)的自动化遗传改造模式对高通量设计的需求日益增加,使得通过计算机辅助设计工具实现精准快速的编辑序列设计愈发重要。本文针对不同阶段实现不同目标的微生物遗传操作技术和相应的编辑序列辅助设计工具的发展进行了综述。按照不同编辑序列类型和遗传操作应用场景,将编辑序列设计工具划分为四种类型:引物设计工具、dna组装的设计工具、sgRNA设计工具、基因组编辑的全流程设计工具,对各类编辑序列设计工具的应用及存在的问题进行了分析总结并对未来的研究方向进行了展望。编辑序列设计工具的发展将有助于实现合成生物学“设计—构建—测试—学习”(designbuild-test-learn,DBTL)工作循环中上游的基因型“设计”与下游“构建”两个关键环节之间的无缝衔接。

摘要：合成生物学采用工程化设计理念,对生物体进行有目标的设计、改造,甚至从头合成具有特定功能的“人造生命”,用于探索生命活动规律和进行生物技术创新.由于生命系统高度复杂,人工设计的合成生命体很难完全按照预期工作,往往需要长时间的反复调谐.目前,“试错”过程主要依靠研究者手动完成,存在通量低、重复性差、迭代慢等局限.针对这一难题,自动化合成生物技术通过低成本、多循环地完成海量工程试错性实验,提高研究通量和效率,大幅增加实验设计的复杂度和系统性,从而快速实现特定功能,揭示人工生命体的设计原理.近年来,在合成生物学“设计-构建-测试-学习”的各个研究环节,自动化技术正在以前所未有的速度加速发展.与此对应,在全球范围内已建成或在建多个大型工程化平台,用于支撑相关研究和应用.本文旨在对自动合成生物技术的关键要素进行总结,并对合成生物研究基础设施的发展情况和未来方向进行讨论.

摘要：合成生物学目前在全球得到迅猛发展。在此专刊中,综述了一些相关技术在合成生物学领域的进展,其中有:链霉菌无痕敲除方法、基因合成技术、dna组装新方法、最小化基因组的方法及分析、合成生物系统的组合优化。也讨论了应用合成生物学策略优化光合蓝细菌底盘、产溶剂梭菌分子遗传操作技术、蛋白质预算(Protein budget)作为合成生物学的成本标尺。最后,用几个例子说明了合成生物学的应用,包括复杂天然产物合成人工生物系统的设计与构建、微生物木糖代谢途径改造制备生物基化学品以及构建酿酒酵母工程菌合成香紫苏醇。