摘要：目的靶向人dnmt1(DNA methyltransferase 1,dnmt1)构建RNA干扰载体,研究其对乳腺癌细胞周期、增殖及凋亡的影响。方法靶向dnmt1基因设计三条短发夹状RNA(short hairpin RNA,shRNA)的寡核苷酸片段,构建重组体pGCsi-dnmt1,转染至乳腺癌细胞株MCF-7,定量PCR法检测dnmt1mRNA表达水平;流式细胞技术分析细胞周期的变化;MTT法检测细胞生长情况;Annexin V/PI双染法观察细胞凋亡情况;定量PCR法分析沉默dnmt1基因后对RASSF1A、p16、p21、p27及ERβ基因表达的影响。结果在构建的靶向dnmt1的shRNA重组质粒pGCsi-dnmt1中,成功筛选到pGCsi-T3能显著下调dnmt1的表达。实时定量PCR检测结果证实重组质粒pGCsi-dnmt1对乳腺癌MCF-7细胞中dnmt1基因的转录有明显的抑制作用。MCF-7细胞转染后,pGCsi-dnmt1可明显抑制乳腺癌MCF-7细胞的增殖;大量细胞发生凋亡;细胞周期分析可见S期明显减少,而G1/G0期细胞显著增加;定量PCR检测到乳腺癌细胞中RASSF1A、p16、p21及ERβ基因mRNA表达水平明显升高,而p27基因表达水平未见明显变化。结论重组质粒pGCsi-dnmt1能特异有效地抑制MCF-7细胞内dnmt1的表达、抑制细胞增殖、促进细胞凋亡,并可通过抑制dnmt1的活性来解除相关基因启动子区的高度甲基化状态,从而促进肿瘤相关基因的表达,提示dnmt1可作为乳腺癌基因治疗的新靶标。

摘要：目的 :本研究利用RNA干扰 (RNAinterfering ,RNAi)技术 ,以dnmt1(DNAmethyltransferase 1)为靶基因 ,设计构建重组体 ,并进行序列分析 ,为下一步探索肿瘤基因治疗的新途径打好基础。方法 :设计有小发夹结构的两条DNA序列 ,经退火成互补双链 ,再克隆至载体pTZU6 +1中构建重组体 ,转化JM10 9菌株 ,提取质粒行酶切鉴定后 ,进行测序分析。结果 :将合成的DNA序列退火后克隆到载体上 ,经测序鉴定确实为所需序列。结论 :dnmt1靶向RNA干扰重组体的成功构建和序列分析 ,可进一步利用克隆所得的小RNA序列干扰dnmt1的mRNA转录 。

摘要：目的 :本研究利用RNA干扰 (RNAinterfering ,RNAi)技术 ,以dnmt1(DNAmethyltransferase 1)为靶基因 ,设计构建重组体 ,研究其对胃癌细胞周期的影响。方法 :设计有小发夹结构的两条DNA序列 ,经退火成互补双链 ,再克隆至载体pTZU6 +1中构建重组体 ,经鉴定正确后 ,转染胃癌细胞AGS ,最后使用流式细胞仪分析细胞周期。结果 :转染后的胃癌细胞的S期细胞较前有明显减少 ,G2 -M期细胞明显增多。结论 :dnmt1靶向RNA干扰重组体转染到胃癌细胞中后促使S期细胞进入G2 -M期 ,最后衰老死亡。从而为肿瘤的治疗开辟了新途径。

摘要：为研究猪miR-148a(ssc-miR-148a)的转录调控机制,对其启动子进行了克隆及分析。本试验首先设计特异性PCR扩增引物,分别得到ssc-miR-148a前体上游3个片段,并将其连接到荧光素酶报告载体pGL3-Basic上。通过生物信息学方法,在线分析ssc-miR-148a启动子大概区域、甲基化部位和转录因子结合部位。将重组报告质粒转染293T细胞,分析启动子活性。采用不同浓度碱性成纤维生长因子(bFGF)处理猪成纤维细胞和转染有重组报告质粒的猪成纤维细胞,检测ssc-miR-148a和DNA甲基化转移酶1(dnmt1)的表达,及其对启动子活性的影响。结果显示,克隆得到的ssc-miR-148a启动子区2 043bp片段具有启动子活性,该序列存在5个CpG岛、Sp1及AP2等转录因子结合位点。0、5和10ng·mL-1浓度bFGF处理猪成纤维细胞和转染重组报告质粒的猪成纤维细胞后,ssc-miR-148a表达均显著下降(P0.05)。结果表明,ssc-miR-148a启动子位于前体上游2 043bp片段内,启动子区域有转录因子SP1结合位点,其表达受bFGF的调控。