摘要：目的构建人类DNA甲基转移酶3A(dnmt3a)蛋白过表达慢病毒载体并建立乳腺癌细胞MDA-MB-231稳定表达株。方法从乳腺癌细胞MDA-MB-231中提取总RNA,逆转录出含dnmt3a的c DNA;以dnmt3a的c DNA为模板,根据其CDS序列设计含有EcoRⅠ和Bam HⅠ限制性内切酶位点的引物序列,采用PCR法扩增出带有双酶切位点的目的基因;采用双酶切法将目的片段连接到到慢病毒表达质粒pLVX-IRES-Hyg中,获得重组的pLVX-FLAG-dnmt3a表达载体。重组的pLVX-FLAG-dnmt3a表达载体通过与包装质粒共转染293T细胞,获得携带FLAG-dnmt3a的重组慢病毒。以慢病毒感染MDA-MB-231细胞,48 h后在培养基中加入1μg/μL的嘌呤霉素,筛选出稳定表达dnmt3a蛋白的细胞株,检测稳定株及野生型细胞dnmt3a蛋白及mRNA表达水平。结果构建的重组质粒经菌落PCR、重组质粒双酶切、质粒PCR验证及测序比对鉴定正确。用病毒感染MDA-MB-231细胞,药物筛选后获得的过表达稳定株中,dnmt3a蛋白及mRNA表达水平分别为13.2±0.48、107.10±0.46,均高于野生型及空载对照。结论成功构建了dnmt3a基因慢病毒表达载体pLVX-FLAG-dnmt3a,并在MDA-MB-231细胞中筛选出稳定表达dnmt3a的细胞株,为进一步探讨dnmt3a在乳腺癌中的作用提供了体外细胞系模型。

摘要：目的:了解dnmt3a基因突变在非髓性白血病的其他恶性血液肿瘤患者中的发生率、分布情况及临床意义。方法:选取196例非髓性白血病的其他血液肿瘤患者为研究对象,提取患者外周血基因组DNA,针对dnmt3a基因突变热点R882位点设计引物,采用聚合酶链式反应(PCR)法扩增dnmt3a基因23号外显子整个编码区基因片段,再将扩增产物纯化后测序,分析dnmt3a基因突变在本组恶性血液病患者中的发生率、分布情况及临床意义。结果:在57例非霍奇金淋巴瘤及34例骨髓增生异常综合征患者中各检出1例伴dnmt3a基因突变,在25例急性淋巴细胞白血病、45例多发性骨髓瘤和35例骨髓增殖性肿瘤患者中均未检测到dnmt3a基因突变。结论:非髓性白血病的其他血液肿瘤患者中dnmt3a基因突变少见,伴dnmt3a基因突变的1例T淋巴母细胞白血病/淋巴瘤患者预后不良,联合去甲基化药物的化疗方案使伴该基因突变的1例骨髓增生异常综合征患者一度获得血液学完全缓解,但短期内转为急性白血病并发严重感染死亡。

摘要：目的:了解dnmt3a基因突变在骨髓增生异常综合征(MDS)患者中的发生率、分布情况及临床意义。方法:选取2012年4月至2018年6月在湘雅二医院和湘潭市中心医院住院的85例MDS患者为研究对象。提取患者外周血基因组DNA,针对dnmt3a基因突变热点R882位点设计合成引物,采用聚合酶链式反应法扩增dnmt3a基因23号外显子整个编码区基因片段,再将扩增产物纯化后测序,分析dnmt3a基因突变在本组患者中的发生率、分布情况及临床意义。结果:85例MDS患者中检测到5例dnmt3a基因突变,突变阳性率5.9%,其中R882H和R882C基因突变各2例,R882P基因突变1例,未见R882S基因突变。常规化疗联合去甲基化药物地西他滨治疗后,1例患者一度获得血液学完全缓解,复杂染色体核型恢复正常,但是1月后转为急性白血病并发严重感染死亡,1例治疗后稳定,2例治疗后疾病进展,1例死于肺部感染。结论:MDS中dnmt3a基因突变率低,其突变多预示预后较差,并可能更快地向急性髓性白血病转化,选择去甲基化药物治疗可能获益。