摘要：目的:应用RNA干扰技术抑制人肝细胞癌细胞系HepG2细胞dcr3表达,并研究dcr3基因沉默后对HepG2细胞凋亡和迁移能力的影响.方法:设计并合成特异性dcr3-siRNA 4条和阴性对照siRNA 1条,转染HepG2细胞,通过半定量反转录-PCR(RT-PCR)及免疫细胞化学方法检测其对dcr3表达的抑制作用并筛选出干扰效果最强的siRNA,应用流式细胞仪、DNA ladder方法检测细胞的凋亡情况,应用划痕实验检测细胞体外迁移能力的变化.结果:各特异性dcr3-siRNA均能抑制dcr3mRNA表达(P<0.05),其中以dcr3-siRNA4的抑制作用最明显,抑制作用达62.9%;将dcr3-siRNA4转染HepG2细胞能明显抑制HepG2细胞dcr3蛋白的表达(P<0.01).流式细胞仪检测结果显示,特异性dcr3-siRNA转染组细胞的凋亡率(22.97%±2.10%)明显高于空白对照组(1.17%±0.32%)、脂质体转染组(1.44%±0.43%)和非特异性siRNA转染组(1.22%±0.40%)(均P<0.001);DNA ladder实验发现特异性dcr3-siRNA转染组出现DNAladder,而空白对照组、脂质体转染组和非特异性siRNA转染组均未出现DNA ladder.划痕实验结果显示,转染后24、48和72 h,特异性dcr3-siRNA转染组细胞的相对迁移率均低于空白对照组、脂质体转染组和非特异性siRNA转染组.结论:dcr3在肝癌细胞的凋亡及迁移中发挥重要作用,抑制dcr3的表达能诱导肝癌细胞凋亡并降低肝癌细胞的迁移能力.

摘要：目的:构建适于原核表达的人诱骗受体dcr3基因,并进行重组蛋白的表达纯化及特异性鉴定。方法:查得人dcr3cDNA全序列,将其分段设计引物,通过重叠PCR获得dcr3基因。构建pET-22b(+)/dcr3表达载体,转化大肠杆菌Rosseta-gami,IPTG诱导表达,Ni柱纯化。采用ELISA进行特异性鉴定。结果:通过重叠PCR获得了编码正确氨基酸序列的目的基因。目的蛋白以包涵体的形式表达,表达量占菌体总蛋白的30%以上。纯化后,蛋白纯度达95%以上。ELISA结果表明所纯化的蛋白可与抗dcr3抗体发生特异结合。结论:诱骗受体dcr3基因的成功构建、表达及纯化,为进一步的功能研究奠定了基础。

摘要：目的观察宫颈癌组织诱捕受体3(decoy receptor 3,dcr3)表达与高危型人乳头状瘤病毒(high-risk human papilloma virus,HR-HPV)感染的相关性。方法分别采用免疫组织化学(streptavidin-perosidase,SP)法和第2代杂交捕获法检测35例正常宫颈组织(normal cervical tissues,NCE)、39例宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasm,CIN)及44例宫颈癌组织(cervical squamous epithelial carcinoma,CSES) dcr3和HR-HPV的表达。设计并合成靶向HR-HPV16E7基因的HR-HPV16 E7小干扰RNA(siRNA)和阴性对照HR-HPV16 E7 siRNA,脂质体法转染SiHa细胞,实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)法和蛋白质印迹(western blot,WB)法检测HR-HPV16 E7基因沉默对dcr3 mRNA和蛋白表达的影响,四甲基偶氮唑盐比色(methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide,MTT)法检测细胞增殖情况。结果NCE、CIN及CSES组dcr3蛋白阳性表达率分别为8. 6%(3/35)、48. 7%(19/39)、77. 3%(34/44),表达呈逐渐增高趋势,差异具有统计学意义(X^2=36. 942,P <0. 001)。NCE、CIN及CSES组HR-HPV阳性检出率分别为5. 7%(2/35)、56. 4%(22/39)、93. 2%(41/44),差异具有统计学意义(X^2=60. 322,P <0. 001)。dcr3表达与HR-HPV感染呈正相关(r=0. 893,P=0. 004)。HR-HPV基因沉默后dcr3在mRNA和蛋白水平的表达均明显降低,且细胞增殖受到抑制。结论 dcr3在宫颈癌中异常高表达,其表达升高与HR-HPV感染密切相关,提示dcr3可能参与了宫颈癌的发生发展。siRNA技术成功诱导HR-HPV基因沉默可通过下调dcr3的表达抑制人宫颈癌Si Ha细胞增殖。

摘要：AIM To investigate the enhanced cytotoxic T lymphocyte responses against pancreatic cancer (PC) in vitro induced by dendritic cells (DCs) engineered to secrete anti-dcr3 monoclonal antibody (mAb). METHODS DCs, T lymphocytes and primary PC cells were obtained from PC patients. DCs were transfected with a designed humanized anti-dcr3 monoclonal antibody heavy and light chain mRNA and/or total tumor RNA (DC-tumor-anti-dcr3 RNA or DC-total tumor RNA) by using electroporation technology. The identification, concentration and function of anti-dcr3 mAb secreted by DC-tumor-anti-dcr3 RNA were determined by western blotting and enzyme-linked immunosorbent assay. After co-culturing of autologous isolated PC cells with target DCs, the effects of secreting anti-dcr3 mAb on RNA-DCs&#39; viability and apoptosis were assessed by MTT assay and flow cytometry. Analysis of enhanced antigen-specific immune response against PC induced by anti-dcr3 mAb secreting DCs was performed using a Cr-51 releasing test. T cell responses induced by RNAloaded DCs were analyzed by measuring cytokine levels, including IFN-gamma, IL-10, IL4, TNF-alpha and IL-12. RESULTS The anti-dcr3 mAb secreted by DCs reacted with recombinant human dcr3 protein and generated a band with 35 kDa molecular weight. The secreting mAb was transient, peaking at 24 h and becoming undetectable after 72 h. After co-incubation with DCtumor- anti-dcr3 RNA for designated times, the dcr3 level in the supernatant of autologous PC cells was significantly down-regulated (P < 0.05). DCs secreting anti-dcr3 mAb could improve cell viability and slow down the apoptosis of RNA-loaded DCs, compared with DC-total tumor RNA (P < 0.01). The anti-dcr3 mAb secreted by DC-tumor-anti-dcr3 RNA could enhance the induction of cytotoxic T lymphocytes (CTLs) activity toward RNA-transfected DCs, primary tumor cells, and PC cell lines, compared with CTLs stimulated by DC-total tumor RNA or control group (P < 0.05). Meanwhile, the antigen-specific CTL respon

摘要：目的研究靶向干扰dcr3基因对人肝癌HepG2细胞凋亡的影响并探讨其可能的分子机制。方法设计并合成dcr3基因的特异性dcr3 siRNA(实验组)和非特异性dcr3 siRNA(对照组),在脂质体介导下分别转染HepG2细胞株。Western blot检测两组dcr3 siRNA转染HepG2细胞24和48 h后dcr3蛋白表达水平;MTT法检测转染48 h细胞生长增殖;流式细胞术、DNA琼脂糖凝胶电泳检测转染24 h细胞凋亡;免疫组化法检测转染24 h细胞caspase3蛋白的表达。结果实验组细胞24和48 h dcr3蛋白相对表达水平分别为(0.532±0.051)和(0.417±0.044);对照组分别为(1.978±0.246)和(2.018±0.275);两组比较,相同时间点相对表达水平差异有显著性(P0.05)。两组细胞转染48 h抑制率分别为(59.8±5.4)%和(0.8±0.1)%,两者比较差异有显著性(P<0.05);两组细胞转染24 h凋亡率分别为(19.7±3.2)%和(6.9±0.8)%,两者比较差异有显著性(P<0.05);转染24 h后两组caspase3蛋白阳性率分别为72.8%和38.9%,平均光密度值分别为(0.41±0.06)和(0.21±0.03),两者比较差异有显著性(P<0.05)。结论特异性dcr3 siRNA有抑制人肝癌HepG2细胞dcr3蛋白表达、细胞增殖和诱导凋亡的作用,其机制可能与上调caspase 3的表达有关。

摘要：目的探讨特异性诱捕受体3(decoy receptor 3,dcr3)的siRNA对HepG2细胞生物学特性的影响。方法设计并合成针对dcr3的siRNA,用脂质体转染HepG2细胞,通过半定量RT-PCR及免疫细胞化学法检测其对dcr3表达的抑制作用;应用MTT法、流式细胞术、划痕实验检测转染后HepG2细胞增殖、凋亡及迁移能力的变化。结果特异性dcr3-siRNA能抑制dcr3 mRNA和蛋白表达(P<0.05);MTT实验结果:转染后24、48和72 h特异性dcr3-siRNA转染组细胞吸光度值低于空白对照组、脂质体转染组及非特异性siRNA转染组(P<0.001),特异性dcr3-siRNA转染组细胞的增殖抑制率在24、48和72 h分别为20.71%、35.00%和34.04%;转染后72 h,特异性dcr3-siRNA转染组细胞与空白对照组、脂质体转染组及非特异性siRNA转染组细胞相比,G1期细胞比例增多而G2/M期细胞比例减少(P<0.01);流式细胞仪检测细胞凋亡结果显示,特异性dcr3-siRNA转染组细胞凋亡率(22.97%±2.10%)高于空白对照组(1.17%±0.32%)、脂质体转染组(1.44%±0.43%)及非特异性siRNA转染组(1.22%±0.40%)(P<0.001);划痕实验结果显示,转染后24、48和72 h,特异性dcr3-siRNA转染组细胞的相对迁移率均低于空白对照组、脂质体转染组及非特异性siRNA转染组细胞(P<0.001)。结论特异性dcr3-siRNA能有效抑制肝癌细胞系HepG2的dcr3表达,诱导细胞凋亡,并能抑制HepG2细胞的增殖和迁移能力。

摘要：目的探讨特异性dcr3-siRNA对人肝细胞癌细胞系HepG2的dcr3基因表达的影响。方法设计并合成带FAM荧光标记的针对dcr3的siRNA4条和非特异性siRNA1条,用脂质体转染HepG2细胞,应用荧光显微镜和流式细胞仪判断转染效果;应用半定量RT-PCR和免疫细胞化学检测特异性dcr3-siRNA的对HepG2细胞中dcr3表达的抑制作用。结果各特异性dcr3-siRNA均能抑制dcr3 mRNA表达(P<0.05),其中以siRNA4的作用更明显,干扰作用达62.9%;将siRNA4转染HepG2细胞,免疫细胞化学结果显示,siRNA4能明显抑制HepG2细胞中dcr3蛋白的表达(P<0.01)。结论特异性dcr3-siRNA在体外实验能抑制目的基因的表达。

摘要：目的以脂质体为载体,探讨靶向诱骗受体3(decoy receptor 3,dcr3)的siRNA对人结肠癌SW480细胞裸鼠皮下移植瘤生长的抑制作用。方法裸鼠背部皮下种植结肠癌SW480细胞,建立结肠癌SW480细胞裸鼠皮下移植瘤模型。针对靶标dcr3基因,利用Dharmacon公司软件设计并合成siRNA序列,通过瘤体局部多点注射脂质体与dcr3 siRNA混合物,将dcr3 siRNA转染到裸鼠背部皮下移植瘤内。同时设立阴性对照组和空白对照组。观察肿瘤治疗前后体积变化,评价dcr3 siRNA对肿瘤的抑制作用;比较肿瘤治疗前后的细胞形态学改变;免疫组织化学及RT-PCR检测dcr3基因表达;原位细胞凋亡检测肿瘤的凋亡情况。结果治疗组肿瘤体积明显小于对照组,肿瘤组织内坏死面积增大,细胞凋亡率显著增高,dcr3蛋白表达水平降低。治疗过程中裸鼠生长良好,无明显毒性反应。结论脂质体介导的dcr3 siRNA对裸鼠皮下结肠癌SW480细胞移植瘤有明显抑制、杀伤作用,细胞凋亡是dcr3 siRNA所致肿瘤细胞死亡的重要形式。

摘要：目的构建基于miR30的靶向dcr3慢病毒干扰载体。方法人工设计针对dcr3编码区的干扰序列,使其转录后RNA结构类似于miR30结构,茎杆序列替换成dcr3序列,送上海生物工程技术服务有限公司合成。以该序列为模板,分别利用携带EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点的引物行PCR扩增,通过酶切连接的方式将插入片段连入p201慢病毒载体骨架中。经酶切和测序鉴定后,用包装质粒pMD2G及包膜质粒psAX2共同转染293FT细胞进行病毒包装。病毒包装上清液加入培养的人食管鳞癌细胞系KYSE150细胞中,用FACS分选后进行RT-PCR和Western blot检测dcr3表达情况。结果构建了针对dcr3的3条慢病毒干扰载体,成功包装出病毒,并不同程度地抑制了dcr3蛋白的表达。结论基于miR-30的dcr3能有效抑制dcr3表达,为进一步研究dcr3功能打下了基础。