摘要：目的;获得JeVe蛋白基因,构建重组表达载体并在***中高效表达。方法:参照GeneBank中的日本乙型脑炎病毒SA14-14株序列设计一对特异性引物,采用RT-PCR法扩增e基因全长,克隆至PUCm-T载体,经测序证实后克隆至原核表达载体peT32a中,转化入BL21(De3),IPTG诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGe电泳分析。结果:限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析表明,扩增出了JeVe蛋白基因全长1500bp,成功构建了重组质粒peT-32a/JeVe,SDS-PAGe分析显示目的蛋白主要以包涵体的形式在大肠杆菌中获得表达,表达量占总菌体蛋白的35%。结论:在大肠杆菌中成功表达了JeVe蛋白,为eLISA早期诊断试剂盒的研制和e蛋白基因结构与功能的分析奠定了基础。

摘要：参考GenBank发表的西尼罗病毒(west nile virus,WNV)的e蛋白基因序列,自行设计合成一对引物,利用RT-PCR扩增出了WMV e基因318bp片段,将其克隆入pMD18-T-Vector载体中,阳性克隆命名pMD-e,并进行序列分析。进一步亚克隆入表达载体peT-32a(+)。重组质粒peT32a-e转化BL21(De3)感受态细胞中表达,表达产物经SDS-PAGe可检测到分子量约为32kD的目的蛋白带,经薄层扫描分析,目的蛋白占菌体总蛋白的33．1%。表达产物纯化后,Wester-blotting分析证明表达产物能被WNV的阳性血清所识别,为下一步建立以表达产物为包被抗原建立检测马的WNV的eLISA方法打下了基础。

摘要：为构建乙型脑炎病毒(JeV)SXBJ07株e基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中进行高效表达;根据JeV SXBJ07株基因组全序列设计1对特异性引物,RT-PCR扩增e基因全长;将目的基因插入pGeM-T连接载体,筛选出阳性重组质粒;将该质粒克隆至原核表达载体peT32α中,再转化入大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达后对其产物进行SDS-PAGe电泳分析和Western-blot检测。结果表明:扩增到了全长为1 500 bp的JeV SXBJ株e蛋白基因;重组质粒peT-32α-e构建成功;融合蛋白可以与乙脑阳性血清抗体特异性结合。说明在大肠杆菌中成功表达了JeV e蛋白。

摘要：根据Genebank公布的乙型脑炎病毒e蛋白基因的序列设计并合成一对特异性引物,以pMD18-T-JeV-e质粒为模板,通过PCR扩增e蛋白抗原Ⅰ、Ⅱ基因片段,所得基因纯化后与PGeX-4T-1同时双酶切并重组构建PGeX-JeV-e12质粒,经过测序确定插入编码框正确后经异丙基巯基半乳糖(IPTG)诱导,观察不同诱导时间、不同IPTG浓度对表达的影响,优化反应条件,对表达产物进行SDS-PAGe电泳和蛋白免疫印迹进行分析.结果通过测序证明重组质粒正确插入读码框成功,转化至感受态细胞中以包涵体形式表达,37℃时最佳诱导条件的反应条件为IPTG浓度0.6mmol/L,诱导时间为8 h;蛋白免疫印迹显示,重组表达蛋白和单抗、多抗均能进行中和反应,无非特异性表达.表明表达蛋白具有良好的抗原性,为进一步进行分析e蛋白基因结构与功能的关系、研制新型eLISA诊断试剂和开发基因工程疫苗奠定了基础.