摘要：为建立一套表达猪瘟病毒e2蛋白的重组杆状病毒反应器工艺,提高反应器上猪瘟病毒e2蛋白的表达量,以商业化培养基为基础,通过对关键营养组分添加量的DOe试验设计优化,获得一种组合补料配方,并在3 L反应器上对补料方式进行优化,以最大限度提高细胞密度。进一步在反应器上摸索了通气策略,以精确调控猪瘟e2重组杆状病毒培养过程的营养代谢平衡,解决副产物乳酸和氨过度积累导致细胞活力下降的问题。首次使用半连续补料工艺与渗透压动态平衡相结合的补料策略以及定向调节通气的工艺模式,使猪瘟病毒e2蛋白的表达量由130 mg/L增加至520 mg/L,提高了3倍。将3 L反应器工艺在100 L反应器上进行了连续3个批次的验证,结果猪瘟病毒e2蛋白的表达量均大于500 mg/L,收获猪瘟e2蛋白制备的疫苗抗体均在2周后转阳,且抗体水平持续上升,接种后8周抗体阻断率仍维持在80%左右。综上,3 L反应器工艺能够稳定放大至100 L反应器,建立了表达猪瘟病毒e2蛋白的重组杆状病毒100 L反应器工艺,且100 L反应器上重组蛋白的表达量稳定、免疫原性良好。

摘要：利用牛病毒性腹泻病毒(BVDV)BA株接种MDBK细胞,提取病毒RNA。参照已发表的BVDV基因组序列,利用Oligo 6生物学软件设计扩增e2基因的1对引物,引入酶切位点并去掉e2蛋白的跨膜区及疏水区。通过RT-PCR扩增了长约1 000 bp的e2基因片段,克隆到pMD18-T载体上,酶切并测序鉴定。然后将目的片段进一步定向克隆到peT30a表达载体,转化BL21表达菌。取转化菌培养,并用IPTG诱导,获得了以包涵体形式表达的重组蛋白。将重组蛋白变性、纯化和复性后,用免疫印迹与间接eLISA检测表明纯化的重组蛋白具有良好的免疫原性,为牛病毒性腹泻病毒诊断试剂的研制奠定了基础。

摘要：根据猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)e2蛋白的序列设计并人工合成18条重叠多肽,与载体蛋白BSA偶联后,利用抗CSFV e2蛋白单克隆抗体SWmAb8筛选该蛋白上的B细胞表位;同时用12肽噬菌体随机肽库淘选e2单抗识别多肽序列。结果显示,多肽序列VSPTTLRTeV能被单抗SWmAb8识别;含SPTxLR基序的噬菌体能被单抗SWmAb8结合,且能被病毒抗原竞争性抑制。证实SPTxLR基序很可能是e2蛋白的线性表位之一,可诱导机体产生中和抗体。

摘要：为进一步精确定位猪瘟病毒(CSFV)e2蛋白配体表位信息,利用DNASIS(Ver.2.5)软件分析设计合成7条多肽,主要覆盖e2蛋白,分别命名为Se21、Se22、Se231、Se232、Se241、Se242、Se03,同时设计合成1条无关多肽CP,均标记FITC。将PK-15细胞作为靶细胞,通过多肽与PK-15细胞结合试验、多肽抑制CSFV感染PK-15细胞试验和CSFV阻断多肽与PK-15细胞结合试验,筛选和鉴定e2蛋白配体表位。结果表明,多肽Se241、Se242与PK-15细胞结合的平均荧光强度分别为74.43±4.59和83.60±3.11,显著高于其他多肽,抑制CSFV感染PK-15细胞的感染抑制率也显著高于其他多肽,同时这2条多肽与PK-15细胞的结合被CSFV有效阻断。证实Se241、Se242多肽为CSFV与靶细胞PK-15细胞结合的配体表位,并能抑制CSFV感染PK-15细胞。本试验为CSFV新型多肽疫苗或免疫佐剂的研制提供依据。

摘要：目的可溶性表达牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)e2蛋白。方法参考BVDV NADL株序列设计1对特异性引物,PCR扩增BVDV NADL株e2全长编码区片段,目的片段经限制性内切酶克隆入质粒p eT28a,经双酶切及测序鉴定后,阳性重组质粒转化*** Rosetta(De3)宿主菌,37℃IPTG诱导表达后,进行SDS-PAGe及Western blot分析;表达的重组蛋白经Ni-NTA Purification System纯化后进行SDS-PAGe鉴定。结果表达的重组e2蛋白相对分子质量约45 000,主要以可溶性形式存在,表达量占菌体总蛋白的38.9%,可与BVDV阳性血清发生特异性反应,纯度达95%以上,浓度约3.8 mg/ml,产量可达4.96 mg/L细菌培养物。结论实现了可溶性重组BVDV e2蛋白在原核表达系统中的表达,并具有较好的生物学活性。

摘要：根据猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)e2基因的保守序列,设计合成一套特异性引物和TaqMan探针,通过对反应体系和反应条件进行优化后,检测其特异性和灵敏性。结果显示,本研究建立的实时荧光定量PCR在101～108范围内线性相关系数为0.997,能够检测到相当于10 copies/μL的病毒核酸,比常规PCR检测方法敏感性强;采用建立的实时荧光定量PCR方法检验猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒和猪圆环病毒2型呈现阴性结果,特异性强;变异系数为0.09%～0.7%,小于1%,具有良好的重复性。本研究建立的猪瘟病毒实时荧光定量PCR方法为临床上猪瘟病毒的诊断和定量研究提供了重要的检测工具。

摘要：为了筛选牛病毒性腹泻病毒(BVDV)e2蛋白的多表位亚单位疫苗,本研究选用4种B细胞预测软件(immunomedicine group、ABCpred、BepiPred、SMVTriP)和2种T细胞预测软件(NetBoLApan、NetMHCIIpan)筛选出重叠肽作为优势表位,通过柔性linker连接成多表位疫苗,使用免疫信息学方法对抗原性、过敏源、理化性质、糖基化位点、二级和三级结构进行评估。通过二硫化物工程提高疫苗稳定性。使用分子对接评估疫苗构建体与免疫受体的结合能力,最后进行silico克隆。结果表明,成功构建17000相对分子质量的可溶性蛋白质,免疫信息学结果表明,疫苗构建体是非过敏性良好抗原,具有一个潜在的N-糖基化位点,在二级结构中α螺旋占约3.2%,β折叠占约43.2%,无规卷曲占约53.6%。三级结构Ramachandran作图发现优势区域中含有88.2%残基,进行细化后优势区域的残基增加到93.5%,3D模型表位作图也证明多表位疫苗具有良好的免疫原性,二硫化物工程确定出3对残留物可以形成二硫键,分子对接表明疫苗构建体与TLR3受体具有高亲和力,最后密码子优化和silico克隆确保设计的亚单位疫苗在大肠杆菌K12表达系统中更高表达。免疫信息学分析表明这种多表位疫苗可以有效表达并能够诱导强烈的T细胞和B细胞免疫应答。本研究为BVDV e2多表位疫苗的设计提供了一种新的方法。

摘要：为高效表达牛病毒性腹泻病毒e2蛋白并制备多克隆抗体,参考牛病毒性腹泻病毒(BVDV)基因组序列设计一对引物,利用RT-PCR扩增出822bp的e2基因片段,经测序鉴定正确后,将其定向克隆至原核表达载体peT32a(+)中,鉴定正确后,在大肠埃希菌BL21(De3)细胞内得到了以包涵体表达形式存在的重组融合蛋白,重组蛋白亲和层析纯化后,免疫印迹鉴定表明重组蛋白能够被牛病毒性腹泻病毒阳性血清特异性识别,具有良好的反应活性。将纯化的重组蛋白免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,间接eLISA测定其抗体效价达1∶25 600。本研究所表达的e2蛋白及制备的多克隆抗体,为e2蛋白结构、功能的研究以及抗原表位的鉴定奠定了基础,为进一步开发牛病毒性腹泻病毒快速检测试剂提供了条件。

摘要：基于猪瘟病毒主要保护性抗原———e2囊膜糖蛋白有两个相对独立的抗原结构单位———B C抗原区和A D抗原区 ,设计引物扩增编码猪瘟病毒e2蛋白B C抗原区的基因 ,将大小为2 61bp的PCR产物插入含有强启动子PAOX1和α MF信号肽序列的巴斯德毕赤酵母 (Pichiapastoris)表达载体pPICZαC中 ,构建成重组质粒pPICZα BC ,酶切线性化后电穿孔导入巴斯德毕赤酵母菌X3 3 中 ,经ZeocinTM 筛选得到 3株高拷贝转化子 ,甲醇诱导表达 ,SDS PAGe和Westernblot及eLISA试验表明 ,酵母培养上清液中含有具有良好反应原性的e2蛋白。

摘要：目的 :用丙型肝炎 (丙肝 )病毒 (hepatitisCvirus,HCV)胞膜蛋白 2 (envelopeprotein 2 ,e2 )胞外区片段 ,构建酵母双杂交体系中“饵”载体 ,明确其在酵母细胞中的表达 ,排除自身激活作用 ,验证其能否用于酵母双杂交体系筛选cDNA文库。方法 :设计引物 ,从本室构建的含中国株Ⅲ型HCVe2片段的载体上 ,扩增出不包含C末端跨膜区的e2片段e2 6 6 1,经ecoRI和PstI双酶切后 ,克隆到酵母双杂交的“饵”载体pAS2 1质粒上 ,构建成载体pAS2 1 e2 6 6 1。阳性克隆经ecoRI和PstI双酶切鉴定后 ,转入酵母中 ,用酵母蛋白抽提物作Western杂交 ,证实其表达 ;滤膜印记杂交验证其有无自身激活作用。结果 :所构建的载体 pAS2 1 e2 6 6 1双酶切后 ,片段大小正确 ;转入酵母后 ,提取酵母质粒 ,PCR扩增出预期大小的片段 ,Western杂交出现阳性条带 ;滤膜杂交 ,转有 pAS2 1 e2 6 6 1和阴性对照pLAM5 ' 1的酵母菌落没有激活报告基因 ,而GAL4全长的阳性对照菌落变为蓝色。结论 :含有HCVe2 6 6 1的“饵”载体构建正确 ,在酵母细胞中能表达出e2蛋白 ,并且没有自身激活报告基因的功能 ,能够应用于酵母双杂交体系。