摘要：目的:构建e2f-1真核表达载体,建立稳定过表达e2f-l的胃癌细胞株,探讨e2f-l基因过表达对胃癌MCC-803细胞化疗敏感性的影响方法:应用Tri zol法从胃癌的癌组织中提取mRNA逆转录合成cDNA,按Gene-Bank公布的e2f-1基因序列设计带有酶切位点的引物并行扩增获得e2f-1的ORf片段;然后经限制性内切酶ecoR l和Hind Ⅲ双酶切后将e2f-1定向克隆到真核表达载体pCMV-HA2中转化筛选用脂质体Lipofectamine2000将该载体转染MGC-803胃癌细胞,然后用含G418的培养基筛选获得具Genectin抗性的过表达e2f-1的胃癌细胞株实时定量PCR( real-time quantitative PCR)和蛋白印迹(Western blotting)技术检测MGC-803/e2f-1细胞内e2f-1表达情况四唑蓝(MTT)法检测MGC-803/e2 f-1组(实验组)、MGC-803/eV组(阴性对照组)和MCC-803组(未转染组)细胞对化疗药物的敏感性结果:重组载体pCMV-e2f-1-HA2经ecoR I和Hind Ⅲ双酶切后得到预期片段,测序结果与报道的e2f-1基因之0Rf完全一致,证明目的基因已成功克隆入真核表达载体,获取具Genectin抗性的细胞克隆、并进行了扩增。RT-PCR和Western blotting实验证实重组载体pCMV-e2f-l-HA2成功转入胃癌细胞内,并稳定过表达e2f-1 MTT法检测发现,5-氟尿嘧啶(5-fL)、阿霉素(ADM)、丝裂霉素(MMC)对MGC-803/e2f、-1组细胞的抑制率分别为71.45%、74.03%、76.72%,均明显高于MGC-803/eV组(45.58%、53.69%、54.58%)和MGC-803组(53.70%、54.67%、55.05%) (P<0.05)结论:成功构建了真核表达载体pCMV-e2f-1-HA2,并建立了稳定过表达e2f-1的胃癌细胞株MGC-803/e2f-1。e2f-1过表达增强了胃癌细胞对化疗药物的敏感性。

摘要：目的探讨e2f-1对胃癌细胞生物学行为影响的分子机制。方法分别抽取转染e2f-1的胃癌MGC-803细胞和未转染e2f-1的胃癌MGC-803细胞的总RNA。纯化mRNA,逆转录合成cDNA标记后,与22K人类基因表达谱芯片进行杂交,扫描后筛选出表达差异的基因。随机选取3个差异表达基因,分别设计引物,用半定量RT-PCR检测验证。结果在21522条基因中,两组细胞间的差异表达基因有740条,其中上调基因405条,下调基因335条。差异基因中有73条功能信息不明。随机选取的3个差异表达基因的RT-PCR结果与基因芯片扫描结果相似,具有相同的方向性。结论胃癌的发生发展是多基因相互作用、多种信号通路相互调节的结果。生物信息学分析显示,e2f-1基因可以通过TP53信号传导途径影响胃癌MGC-803细胞生物学行为的改变,还与众多基因的差异性表达密切相关。

摘要：目的:通过构建人e2f-1基因的小干扰RNA(siRNA)表达质粒,探讨其对胃癌MGC803细胞中e2f-1基因表达的影响。方法:将设计合成的具有短发夹结构的人e2f-1基因siRNA寡核苷酸链退火形成双链,连接入经BamHⅠ和HindⅢ双酶切后的pSilencer4&#183;1-CMVneo表达质粒,并做酶切及测序鉴定。用脂质体把重组质粒转染至细胞,采用实时定量PCR(real-time quantitativePCR)及蛋白印迹(western blotting)技术分别检测e2f-1mRNA及蛋白表达。结果:经酶切及测序鉴定,成功构建了e2f-1 siRNA表达质粒;它可显著抑制MGC803细胞中e2f-1基因mRNA及蛋白表达,与未转染组及阴性对照组细胞比较,分别降低了86&#183;4%、86&#183;1%和81&#183;5%、79&#183;6%。结论:pSilencer4&#183;1-e2f-1重组质粒能抑制人胃癌MGC803细胞e2f-1基因的表达,为进一步e2f-1基因的功能研究及胃癌治疗研究提供了实验基础。

摘要：目的:构建细胞周期相关转录因子e2f-1RNA干扰(RNAi)慢病毒表达载体。方法:选取e2f-1基因的19nt特异性序列,设计针对e2f-1的shRNA序列,应用基因重组技术克隆到pLentiLox3.7(pLL3.7)慢病毒表达载体中,XbaI和NotI进行双酶切和DNA测序鉴定重组克隆,在脂质体的介导下将慢病毒的混合包装载体质粒和包含e2f-1基因RNAi的重组慢病毒载体共转染293fT细胞,包装成病毒48h后,收集病毒颗粒,孔稀释法测定病毒滴度。结果:双酶切证实shRNA正确插入慢病毒载体,DNA测序证实插入的序列正确;293fT细胞包装e2f-1基因RNAi的重组慢病毒载体成功;收集的细胞培养上清液中,病毒的滴度为5&#215;107TU/mL。结论:成功构建人e2f-1基因RNAi慢病毒载体,为研究e2f-1对于胃癌生长的影响提供了稳定的转染细胞载体。