摘要：细胞内存在多种e3酶对核小体上不同赖氨酸位点进行选择性的泛素化,继而招募下游效应蛋白参与调控不同的细胞进程,如转录激活、基因沉默、DNA损伤修复等.近年来,复杂翻译后修饰蛋白质与其复合体化学合成技术的发展,及冷冻电子显微镜、核磁共振、交联质谱等生物物理技术的进步,促进了e3对核小体进行泛素化反应的化学机制的解析.本文综述了四种e3酶(PRC1、BRCA1/BARD1、RNF168和Bre1)对核小体底物进行特异性泛素化修饰的相关化学生物学、生物化学和结构生物学机制研究进展.这些e3酶均通过经典的“精氨酸锚”结合核小体酸性口袋进行定位,再借助e3酶与其他核心组蛋白以及e2酶与DNA等多价互作方式,控制e2酶的活性半胱氨酸朝向底物的特定泛素化位点,诱导泛素从e2酶向底物的位点特异性转移.这些研究揭示了e3酶选择性泛素化核小体的化学原理,阐明了核小体上位点特异性泛素化的生成机制,为设计药物小分子干预细胞内核小体泛素化水平及治疗相关疾病提供了结构基础.

摘要：Cbl-b是一种重要的泛素连接酶e3酶,负责与多种底物蛋白的特异识别,并因此介导特定蛋白的降解。研究表明,Cbl-b缺失可激活自然杀伤细胞,从而阻止肿瘤的扩散转移,因此Cbl-b被认为是一种肿瘤免疫治疗的新靶点。但目前针对Cbl-b蛋白的生化性质以及体外活力测定方法研究较少。本研究构建了Cbl-b不同结构域的重组表达载体。通过对其表达和纯化条件进行优化,确定了Cbl-b的底物结合功能域的最优表达条件,即使用感受态BL21(De3),在IPTG浓度为0.5 mmol/L、温度25℃下诱导10 h。利用亲和柱和分子筛层析联用纯化方法,提纯得到大小为65 kD的GST-Cbl-b(39~368)重组蛋白,其纯度可达95%。进一步,通过药物设计方法,设计并合成带有荧光素标记的Cbl-b底物Cblin-FAM,并利用配体结合实验验证了Cbl-b(39~368)结合底物的活力。本研究得到了具有活力的Cbl-b底物结合功能域并建立了其体外表达纯化方法,为后续发展基于Cbl-b纯酶的体外泛素化检测方法,以及发展新型、特异靶向Cbl-be3酶的调控物提供了物质基础。