摘要：目的构建表达HPV16e7基因的重组腺病毒质粒.方法设计携带酶切位点和无酶切位点的两对引物以扩增ccdBKan目的片段.分别将ccdBKan与质粒pBR322-Ad4-eGFP共转至电转感受态GB08red-gyr462构建两种表达ccdBKan基因的重组Ad4质粒.利用ccdB正反筛选系统与exoCeT/Red重组结合将HPV16e7基因插入Ad4的e1A区,构建表达HPV16 e7基因的重组腺病毒质粒pBR322-Ad4-e 1 Amut-C16e7P,经酶切、测序验证.提取质粒pBR322-Ad4-eIAmut-C 16e7P释放基因组,转染293T细胞以包装和扩增病毒,用病毒感染293T细胞,检测HPV16e7基因在细胞内的转录水平和蛋白表达.重组病毒经肌肉接种BALB/C裸鼠,收集小鼠血清用于病毒中和实验.结果成功构建表达HPV16 e7基因的重组腺病毒质粒,并在293T细胞中成功包装出重组病毒.qRT-PCR和Western blotting验证了重组病毒HPV16 e7基因的成功表达,病毒中和实验结果提示经重组病毒免疫后的小鼠血清能够中和Ad4-HPV16e7.结论成功构建了表达HPV16e7基因的重组腺病毒株,为进一步研究HPV16 e7在癌症发病机制中的作用以及HPV感染相关癌症的治疗方法提供新的思路和依据,并且可能为HPV治疗性疫苗的研究探索提供了一种潜在策略.

摘要：目的:构建人乳头瘤病毒(HPV)11-e7及人干扰素(IFN)α-2b的真核表达载体,并在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中表达。方法:同时用KpnⅠ、ecoRⅠ酶切peT-32a-IFNα-2b-linker-HPV11-e7及pcDNA3.1,将酶切产物纯化回收,两者的回收产物进行连接反应。连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5α,随机挑选阳性克隆并提取质粒酶切鉴定;用脂质体法转染CHO细胞,用免疫荧光法检测融合基因的表达。结果:DNA测序结果显示,成功地将IFN-α-2b-linker-HPV11-e7装入pcDNA3.1的KpnⅠ、ecoRⅠ酶切位点之间,且其序列与设计完全一致;激光扫描共聚焦显微镜观察可见目的蛋白的表达。结论:成功地构建了HPV11-e7及IFNα-2b的真核表达载体,并在CHO细胞中表达,为提高DNA疫苗免疫效果的研究奠定了基础。

摘要：目的 :克隆分析人乳头瘤病毒 16型 (HPV16 )新疆株的e7基因 ;并对e7基因进行突变改造 ,以比较野生型与突变型HPV16e7基因的功能。方法 :根据从中国新疆维吾尔族妇女宫颈癌活检组织标本中提取的DNA ,进行PCR扩增获得HPV16e7基因 ,然后分别将其克隆到pMD18-T载体上进行DNA序列分析。根据HPV16e7基因的特点 ,分别设计点突变引物 ,用PCR的方法进行HPV16e7基因的点突变。结果 :PCR检测显示扩增出HPV16 (新疆株 )e7基因 ;测序结果表明HPV16 -XJ的e7基因全长2 97bp ,与德国标准株一致 ;利用设计突变位点的引物经PCR扩增 ,经序列测定后 ,分别得到了第 70、172、2 71位碱基突变的HPV16e7基因 ;分别构建了野生型与单、双、三点突变的重组质粒pMD18-T -HPV16e7。结论 :人乳头瘤病毒 16型 (新疆株 )e7基因结构与德国标准株相同。HPV16e7基因多点突变的改造 ,为探索HPV16e7基因功能的变化和开展疫苗研究奠定了理论基础。

摘要：目的:以人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)18型e6基因为靶点,研究小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)对宫颈癌Hela细胞株HPV18基因组中恶性转化基因e6、e7的抑制作用及对细胞内P53蛋白表达的影响。方法:实验分细胞培养液阴性对照组(阴性对照组),无关序列siRNA对照组(无关序列对照组)及转染HPV18 e6-siRNA实验组(siRNA实验组)。设计并合成HPV18 e6-siRNA及无关序列siRNA,转染Hela细胞后,RT-PCR检测转染后48、120 h细胞内HPV18e6、e7mRNA的变化,Western blotting检测转染后48 h细胞内HPV18 e7和P53蛋白的变化。结果:siRNA转染Hela细胞的效率约为85%。siRNA转染后48 h,实验组细胞内HPV18e6、e7mRNA及e7蛋白含量降低,其含量分别为阴性对照组的33.33%、36.78%及33.84%;实验组细胞内P53蛋白含量增加,其含量为阴性对照组的2.194倍。siRNA转染后120 h,实验组细胞HPV18e6、e7mRNA含量恢复为阴性对照组的90.91%、101.60%。结论:HPV18 e6-siRNA体外能明显抑制宫颈癌Hela细胞HPV18e6、e7基因的表达,增加细胞内肿瘤抑制因子P53蛋白的水平。

摘要：人乳头瘤病毒１６型Ｅ７基因是转化基因。作者设计了一对ＰＣＲ引物，在引物的５′端分别引入ＥｃｏＲＩ和ＨｉｎｄⅢ酶切序列，以ＨＰＶ１６ＤＮＡ为模板成功地扩增出Ｅ７基因。通过ＥｃｏＲＩ和ＨｉｎｄⅢ双酶切位点将Ｅ７基因定向克隆入ｐＵＣ１８载体，经过ＰＣＲ、酶切分析和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交鉴定得到Ｅ７重组克隆ｐＨＳＥ７、ＤＮＡ序列分析表明所克隆的Ｅ７基因与已发表的ＨＰＶ１６Ｅ７基因序列完全一致且读框正确。

摘要：目的分析人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)52型e 6和e 7基因突变位点分布,评估基因突变与宫颈癌及癌前病变的相关性。方法收集2016年1月至2017年5月经HPV DNA检测为HPV 52单独阳性的DNA样本120例。应用Generunner V 3.01软件设计扩增e 6/e 7区域的1对PCR引物和Sanger测序的4条延伸引物。以HPV 52原型(Gen Bank Accession No.X 74481.1)作为参考序列,应用MeGA 5.05软件分析每个样本的碱基序列和蛋白序列的变异;应用SPSS 17.0进行一般线性相关检验和Fisher's检验或者Pearson Chi-square(χ~2)检验,分析e 6和e 7基因突变与宫颈病变的关系。结果在104例样本中,共发现HPV 52 e 6基因的16个突变位点和e 7基因的17个突变位点。HPV 52 e 6和e 7基因中不同突变位点的突变率差异无统计学意义(χ~2=14.829、12.548,P=0.464、0.766)。在HPV 52 e 6和e 7基因的33种突变中,无突变位点的突变率随着宫颈病变等级恶化有升高或降低的趋势(P>0.05)。HPV 52 e 6基因在CIN 1+样本中的突变频率(14.0%)显著低于正常样本中突变频率(34.4%),(OR=0.31,95%CI=0.11~0.85,χ~2=5.500,P=0.019)。e 7基因的突变频率在CIN 1+样本中的突变频率(16.3%)也低于在正常样本中的突变频率(27.9%),但差异无统计学意义(OR=0.50,95%CI=0.19~1.35,χ~2=1.908,P=0.167)。结论在单独感染HPV 52的条件下,e 6基因突变是阻碍宫颈病变和宫颈癌发生发展的因素。

摘要：目的探讨广东地区宫颈癌组织中HPV16肿瘤相关性抗原e7基因序列的多态性。方法采用通用引物PCR直接测序法对宫颈癌标本中的HPV分型,从含有HPV16型的标本中采用自行设计的多重引物通过巢式PCR扩增出HPV16e7,经DNA序列测定法检测其基因变异,进而寻找其热点突变。结果50例宫颈癌组织HPV-DNA的检出率为78%,其中HPV16和HPV18型混合感染18例,单纯HPV16型感染15例。33例含有HPV16型的标本中扩增出25例HPV16e7,其中17例647位核苷酸“T”变异“C”,导致相应的蛋白质由天冬氨酸变异为丝氨酸。结论广东地区宫颈癌组织中HPV16e7DNA序列发生碱基替换的区域主要在647位至846位,热点突变点为Nt647和Nt846。

摘要：目的　探讨优化密码对人乳头瘤病毒 6b型 (HPV 6b)基因表达及免疫原性的影响 ,为治疗性DNA疫苗的研究奠定基础。方法　设计合成含优化密码及pRB结合位点突变的HPV 6be7(hu me7)全长基因。测序验证无误后 ,定向克隆于pcDNA3的KpnⅠ和ecoRⅠ位点 ,成功构建真核表达质粒pcDNA3 hu me7。体外转染COS 1细胞 ,免疫荧光检测其e7蛋白表达。C57BL 6小鼠胫前肌内接种裸DNA ,观察其诱导的细胞免疫反应。结果　pcDNA3 hu me7在COS 1细胞获得明显表达 ,表达产物主要位于细胞核中。DNA免疫结果显示 ,与含有野生型e7基因的表达质粒pcDNA3 wte7比较 ,pcDNA3 hu me7免疫小鼠脾细胞培养上清中IFN γ产生明显升高 ,CD8+ 和CD4 + 淋巴细胞活性增强。结论　优化密码能促进HPV 6be7蛋白表达及DNA疫苗诱导的细胞免疫反应。

摘要：目的构建HPV11-e7与人干扰素a-2b(IFNa-2b)融合基因表达载体,并进行原核表达。方法通过连接肽将HPV11-e7与人IFNa-2b连接并克隆至原核表达载体pe7-32a,进行酶切鉴定及DNA序列分析。将重组质粒转染*** BL21,经IPTG诱导后对其表达产物进行SDS-PAGe和Westernblotting分析。结果测序结果表明将HPV11-e7和人IFNa-2b通过连接肽(G-G-S-G-S)_3连接并克隆至peT-32a,且其基因序列与设计完全一致。SDS-PAGe和Western blotting分析结果均显示在相对分子质量约50 000位置可见明显蛋白条带。结论 HPV11-e7与人IFNa-2b融合基因表达载体的成功构建及表达,为今后的相关实验研究奠定了基础。