摘要：传统pcr方法不能诊断柑橘溃疡病菌(Xanthomonas citri *** Gabriel)的死活状态,往往导致假阳性检测结果。本研究将特异性核酸染料叠氮溴化乙锭(ethidium monoazide bromide,ema)与pcr技术结合,旨在建立柑橘溃疡病活菌的快速检测技术。根据柑橘溃疡病菌独有的保守蛋白基因设计特异性引物扩增出278bp的靶带,pcr反应的检测下限为25个细胞/25μL或2.75pg/25μL。ema-pcr结果表明:当卤钨灯曝光时间1min,ema终浓度为1.0mg/L时,能有效抑制1.0×108 cfu/mL死菌的扩增;当ema的浓度小于30mg/L时,ema对上述相同浓度活菌靶基因的扩增没有明显的抑制。ema-pcr对死活混合菌的扩增表明,活菌数在6.875×101～6.875×105 cfu/pcr范围时,荧光强度与混合体系中活菌的对数值有线性关系。基于以上建立的ema-pcr活体检测技术,对疑似带病柑橘材料进行检测,结果发现能降低柑橘溃疡病菌检测过程中的假阳性,有望为柑橘溃疡病的检疫检验提供更科学的技术手段。

摘要：根据沙门氏菌保守的侵袭蛋白A(invasion protein A,invA)基因序列设计特异性引物,对实验菌株进行pcr检测,结果只有沙门氏菌能扩增出大小为285bp的特异性条带,而其他对照菌株未扩增出条带。本研究利用ema能穿过死细菌的细胞膜并在光激活的作用下能与基因组DNA共价结合,从而能抑制死菌DNA进行pcr扩增的特性,建立了一种快速、有效的检测沙门氏菌活菌的ema-pcr方法,从而避免了因分析的样品中含有死细菌而造成的假阳性检测结果。该方法较传统pcr大大提高了检测的准确性和真实性,检测灵敏度可达11CFU/ml。

摘要：肠出血性大肠杆菌O157∶H7是一种重要的人畜共患传染病病原菌。为建立一种特异、灵敏的O157∶H7新型检测技术,以O157抗原基因(rfbE基因)为模板设计特异性引物,利用叠氮溴化乙锭(ethidium monoazide bromide,ema)处理菌液,沸水浴法制备细菌裂解液,优化pcr条件,建立一种快速、有效的O157∶H7活菌ema-pcr检测方法。结果显示:ema-pcr可从rfbE基因阳性菌株CVCC248和两株临床分离菌株cd0912、cd0803中扩增出大小为495 bp的特异性条带,检测灵敏度可达12 CFU/mL。经ema处理,从含有1%～100%O157∶H7 CVCC248活菌混合悬液制备的DNA中均可扩增出目的片段。因此,成功建立了肠出血性大肠杆菌O157∶H7的ema-pcr检测方法;该方法可避免因分析的样品中含有死细菌而造成的假阳性检测结果,检测的准确性和真实性较传统pcr大大提高。O157∶H7 ema-pcr技术的建立为O157∶H7的临床诊断提供了新的方法,具有重要的实际应用价值和良好的应用前景。