摘要：为探究稀有物种山东银莲花在全光照的山顶灌丛和阴暗的针阔混交林下两种不同生境中的生态适应机制,并开发其est-ssr分子标记,该研究利用Illumina高通量测序技术对开花期的山东银莲花叶片进行转录组测序,获取其功能注释和差异表达基因(DEGs)。结果表明:(1)转录组测序共得到53536条Unigenes序列,其中27448条成功获得注释。(2)差异表达基因5635个,1600个在山顶灌丛的山东银莲花中上调表达,其余4035个下调表达。有2460个差异表达基因注释到GO数据库2533个三级条目中,1051个差异表达基因注释到KEGG数据库的113条代谢通路中。(3)山东银莲花适应于异质生境的代谢通路主要涉及光合作用-天线蛋白通路和类黄酮生物合成通路,光合作用-天线蛋白通路中lhca 5基因上调表达,lhcb 1、lhcb 2和lhcb 3基因下调表达,类黄酮生物合成通路中chs、c 4 h、f 3′h、f 3 h、fls、ans、chi、ccoaomt和hct基因均上调表达。(4)从山东银莲花转录组数据中共获得7146个ssr位点分布于6006条Unigenes序列中,共计106种重复基序,优势重复基序为单核苷酸重复。设计合成100对est-ssr引物中共有68对引物具有有效性,其中11对具有多态性,共扩增24个多态性片段。该研究首次开发了山东银莲花est-ssr分子标记,为山东银莲花的保护和利用提供了重要的分子标记资源。

摘要：通过ssr Finder软件及MISA技术从NCBI系统中的绵羊表达序列标签(est)数据库中筛查ssr位点,利用Primer 3.0设计绵羊est-ssr荧光引物,对宁夏滩羊肉、新疆细毛羊肉和藏绵羊肉进行区分。以3种绵羊的肝脏DNA为模板,对设计的est-ssr引物进行PCR扩增并使用毛细管电泳检测ssr分型。结果显示,通过est-ssr标记设计的荧光引物p2105.1:248-559、p2025.1:896-1059和p2104.1:704-1015在宁夏滩羊肉、新疆细毛羊肉和藏绵羊肉中具有良好特异性,可实现3个绵羊品种的区分。通过est-ssr标记技术可准确判断3个纯种绵羊肉的品种,这对绵羊遗传资源的开发利用、品种鉴别以及丰富分子标记类型具有重要的意义。

摘要：【目的】对入侵性致瘿害虫桉树枝瘿姬小蜂(膜翅目:姬小蜂科)进行est-ssr引物开发和隐种鉴定,为桉树枝瘿姬小蜂种群遗传学研究及其防治提供理论依据。【方法】采用Illumina HiSeqTM 2000测序平台对3个地理种群的桉树枝瘿姬小蜂雌性成虫进行转录组测序,利用MISA和Primer Premier 3软件进行est-ssr标记的搜索、挖掘和引物设计。选取400对est-ssr引物,结合国外报道的14对多态性G-ssr引物,应用1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增效率,并用8%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳验证引物多态性。基于桉树枝瘿姬小蜂COI基因序列数据对我国14个地理种群320个桉树枝瘿姬小蜂雌性成虫样本进行隐种鉴定。【结果】1)共获得277048525条clean reads,包括82.86 G个核苷酸,组装后得到44878个unigene,平均长度1082.76 bp,N50为1976 bp;利用MISA软件搜索到est-ssr位点14190个,其中主要重复类型是单核苷酸重复(占总est-ssr的69.63%),其次是二核苷酸重复和三核苷酸重复(分别占总est-ssr的16.17%、13.51%)。2)400对est-ssr引物中有205对引物可有效扩增出目的片段,扩增效率51.25%,国外报道的14对G-ssr引物均能扩增出目的片段;3)用8%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳验证ssr引物多态性,最终筛选出10对多态性良好的est-ssr引物,国外报道的14对G-ssr引物中仅有LiSS2、LiSS5、LiSS13在我国桉树枝瘿姬小蜂样本中存在多态性;4)从我国14个桉树枝瘿姬小蜂地理种群中共获得320条605 bp的COI基因序列,基于桉树枝瘿姬小蜂COI基因序列构建的NJ系统发育树表明,我国仅存在A、B 2种类型的桉树枝瘿姬小蜂隐种,样本比例约为1∶2。【结论】筛选出10对适合我国桉树枝瘿姬小蜂种群遗传学研究的est-ssr引物。我国存在A、B 2种类型的桉树枝瘿姬小蜂隐种,其中隐种A首次在我国发现,桉树枝瘿姬小蜂的隐种鉴定可为该害虫在生物防治中采用正确的生物型提供依据。

摘要：目的:通过球孢虫草、蛹虫草est设计est-ssr引物,建立虫草属est-ssr标记系统。方法:从NCBI公共数据库下载获得虫草est,利用Sequece Seiners 1.2软件去除冗余序列并设计引物,进行PAGE电泳。结果:通过去除est总序列中低质量的和冗余的序列后,得到全长为2 953 173 bp的4 556条无冗余球孢虫草est。从中发掘出718个est-ssr,分布于616条est中,出现频率是15.8%。平均分布频率是每4 096 bp出现1个,三核苷酸重复序列有419个,是出现最多的重复类型。蛹虫草est去冗余后得到1 363条无冗余est,共含有1 117个est-ssr,出现频率为81.95%,出现最多的重复类型是A核苷酸重复。根据球孢虫草est-ssr序列,设计合成50对引物,有扩增产物的引物为34对,占总设计引物数的68%。根据蛹虫草est-ssr,设计合成40对引物,有扩增产物的引物为39对,占总设计引物数的97.5%。基于ssr标记进行聚类分析,7种虫草无性型均能分开,且分为4支。结论:虫草属est-ssr出现频率较高、类型较丰富、多态性潜能较高,具有较高的利用价值。球孢虫草和蛹虫草est开发的ssr标记在虫草属有较好的转移性与通用性,可以很好的应用于虫草种间遗传关系的研究。应用虫草物种est建立分子标记是一条简便而又有效的途径。

摘要：【目的】了解各对est-ssr引物检出的等位简单序列重复片段数量,解析吉县良种基地刺槐无性系种质的多态性状况与种质间亲缘关系,为引物利用和刺槐种质遗传管理提供参考。【方法】利用课题组开发的45对est-ssr引物进行PCR扩增,使用毛细管电泳仪对产物进行检测,用Popgene 1.32版软件对群体遗传参数进行评估,利用NTsys 2.10e进行聚类分析。【结果】45对est-ssr引物中,除了引物RP-24均表现出良好的多态性。44对引物共检测到等位重复序列298个,每对引物检测到2~15个,平均6.77个。群体观测杂合度(Ho)的变化范围为0.022 7~0.842 1,平均为0.412 6。期望杂合度(He)的变化范围为0.088 7~0.822 3,平均为0.484 0。引物多态性信息量(PIC)变化范围为0.085 2~0.796 6,平均为0.444 4。【结论】该基地的刺槐无性系种质具有较高的遗传多样性。由聚类结果可知,在遗传距离为0.81时,可将96份刺槐无性系种质聚成5类。聚类图在分子水平上显示了刺槐无性系种质间的亲缘关系,研究结果对于利用这些引物用于刺槐的种质评价、资源管理和辅助育种有积极的参考价值。

摘要：【目的】杜仲为雌雄异株多年生木本植物,具有重要的药用价值与经济价值,其利用价值因植株性别而异,尤其是杜仲胶含量及其他次生代谢产物在雌雄植株中都存在差别,但杜仲在开花前采用形态学和细胞学方法很难分辨其性别,且需要7年以上才能开花。因此,本研究应用est-ssr标记开发杜仲性别相关的分子标记,以期能在早期鉴定出雌雄植株,提高杜仲资源利用率。【方法】根据杜仲雌雄植株转录组文库中est-ssr的两翼序列设计引物,利用来源于7个产地的杜仲雌雄植株各6份DNA样品筛选引物,PCR扩增获得具性别差异的扩增产物,将扩增产物进行克隆及序列分析,应用雌雄植株各12份DNA样品检验性别标记的可靠性。【结果】从140对est-ssr引物中筛选出1对引物est-Eu059,在雌、雄植株中产生差异条带,雌、雄植株均有1条约160 bp的序列(分别命名为Eu-f160和Eu-m160),而雄株多1条约120 bp的序列(Eu MSM)。序列分析发现,Eu-f160与Eu-m160均为156 bp,具有重复单元(GT)6,且仅有1个碱基不相同,即雌株重复单元内第3个G碱基变成了A,可能发生了突变;Eu MSM为112 bp,缺失了(GT)6重复单元。经Blastn比对,Eu MSM序列与Gen Bank数据库中的现有序列没有同源性。用杜仲雌、雄植株基因组DNA各12份进行验证表明,在所有雄株中都有1条雄性特异序列。【结论】本研究筛选出了1对可以鉴别杜仲雌雄株性别的引物est-Eu059,该标记在雄株中具有1条特异序列片段Eu MSM。该标记可在杜仲生长早期快速、可靠地鉴定其性别。

摘要：为开发可用于拟轮枝镰孢菌Fusarium verticillioides及其近缘种遗传多样性分析的ssr引物,利用生物信息学方法和PCR技术,通过对从NCBI下载的87 086条拟轮枝镰孢菌的est序列信息进行分析,设计est-ssr引物,检测其在拟轮枝镰孢菌及其近缘种中的扩增情况,并用筛选出的多态性引物对15株拟轮枝镰孢菌进行ssr遗传多样性分析。结果表明,在est序列中,共查找到11 952个ssr位点,592种重复基元,ssr出现频率为1.09%,重复基元出现数量最多的为三核苷酸(54.00%),其中(CAA/TTG)n基元出现频率最高。设计的25对est-ssr引物在拟轮枝镰孢菌种内的有效扩增率和多态率分别为80.00%与32.00%,对5种近缘镰孢菌种的通用率和多态率分别为40.00%和8.00%。遗传多样性分析结果表明,在相似系数为0.664水平下,供试菌株可划分为4个ssr类群,但类群的划分与菌株的地理来源无关;不同菌株间存在明显的遗传分化。表明基于拟轮枝镰孢菌est序列开发的ssr引物可用于拟轮枝镰孢菌及其近缘种的遗传多样性分析。

摘要：[目的]本研究通过对蒙古沙棘"向阳"品种的转录组序列进行ssr引物开发,为沙棘亲本分析、遗传多样性和遗传育种等研究提供支持。[方法]利用已测得的转录组序列进行分析和筛选,整理具有ssr位点的序列,进行引物设计,随机挑选179条引物进行验证。[结果]得到具有ssr位点的est序列17 383条,其中,单核苷酸、二核苷酸和三核苷酸重复基元分别占62.77%、21.82%和13.77%;二核苷酸重复基元类型以AT和AG为主,三核苷酸重复基元类型以AAG、ATC和ATA为主。9 291条序列设计出扩增est-ssr位点的引物,随机合成的179对引物中,142对扩增成功,选取其中92个位点的扩增产物上机检测,40个ssr位点(43.48%)呈现多态。对扩增稳定且峰图清晰的17个多态位点的进一步分析,得到蒙古沙棘天然群体在各位点的观测杂合度(HO)为0.083 0.875,期望杂合度(HE)为0.180 0.750。[结论]本研究开发出的est-ssr标记,为后期进行沙棘属植物遗传多样性分析、遗传图谱构建及分子育种等研究提供了重要支持。

摘要：利用L16(45)正交实验设计,针对模板DNA,镁离子(Mg2+),d NTPs,Taq DNA酶和引物5个因素进行正交优化,建立适用于桂花Osmanthus fragrans表达序列标签-简单重复序列(est-ssr)的最优扩增反应体系,将其用于桂花转录组est-ssr多态性引物的筛选,最后利用筛选得到的多态性引物和聚类分析对14份四川省常见的栽培丹桂(SC01~SC14)样本进行品种鉴定。结果表明:桂花est-ssr最优反应体系包含40 ng模板DNA,2.25 mmol·L-1Mg2+,0.3μmol·L-1引物,0.3 mmol·L-1d NTPs,1.25×16.67 nkat Taq DNA聚合酶,10×PCR Buffer缓冲液2μL,双蒸水补至20μL;从150对est-ssr引物中筛选得到了19对稳定性好、多态性高的ssr引物,多态性从高到低依次为五核苷酸(25.00%),六核苷酸(19.44%)和三核苷酸(16.67%)重复类型。利用筛选得到的3对高度多态性ssr引物(OF8623-1677,OF24299-844和OF28774-2088)对四川省成都市周边常见栽培的14份丹桂(Aurantiacus group)样本进行了有效鉴定。结果表明:14份样本中,有12份可判定为‘朱砂丹桂’‘Zhusha Dangui’,SC06为‘堰红桂’‘Yanhong Gui’,SC08与‘满条红’‘Mantiao Hong’和‘状元红’‘Zhuangyuan Hong’亲缘关系较近。本研究也为今后利用est-ssr标记对桂花指纹图谱构建、遗传多样性分析、分子育种及品种鉴定与保护等工作奠定基础。

摘要：为了给西瓜遗传基础研究提供新的共显性分子标记,对公共数据中的8 619条西瓜est序列进行处理和分析,获得202个est-ssr,分布在191条est序列中,出现频率为2.31%,分布密度为1/19.1 kb。其优势重复基序为二核苷酸和三核苷酸（68.8%）,在二核苷酸基序中以AG/TG类型为最多（46%）;在三核苷酸基序中,以AAG类型为最多（43%）。基序重复次数以4次（17.8%）、7次（15.3%）和11次（14.9%）为最多。长度主要分布在20~30 bp（76%）。利用上述est-ssr序列设计获得24对引物在西瓜白化致死近等基因系中进行验证,结果获得了16对有效的扩增引物,占总设计引物对数的66.7%。结果表明：利用公共数据库中的est序列开发西瓜est-ssr标记是一种有效的方法。