摘要：树鼩是灵长类动物的近亲,且具有体型小、繁殖周期短、饲养管理成本低等优点,长期以来被认为有望替代灵长类动物用于人类疾病的动物模型研究。该文研究了肠道病毒ev71对幼年中缅树鼩的感染特点,探索建立ev71感染树鼩动物模型及替代灵长类动物的可行性。实验分别采用灌胃、滴鼻和尾静脉注射3种方式,感染3月龄树鼩,定期观察动物临床症状和血常规变化和定期采集血液和粪便样品,并使用中和抗体试验、reverse transcription-PCR(RT-PCR)和Real-TimePCR等技术,检测相关样品中和抗体效价、病毒核酸及载量变化。结合组织病理学检查,分析感染病变特点。研究结果发现,实验组树鼩体温在第4天前后开始升高,白细胞、淋巴细胞也有类似趋势;3种攻毒方式均可检测到病毒载量,峰值出现在第10天前后,灌胃途径尤为明显,血清的最大中和抗体效价为1:16。感染ev71病毒的树鼩2周左右出现急性松弛性瘫痪,大体解剖发现伴有尿潴留症状,组织病理学检查发现在脑、肺、肠、脾脏、肾脏等部位发生病变。结果表明,ev71病毒通过灌胃、滴鼻和静脉注射3种方式均可以感染中缅树鼩,并使之出现神经系统及相关病变,该实验为将来研究ev71感染树鼩致病机理、建立手足口病树鼩动物模型奠定了理论基础。

摘要：目的建立多重聚合酶链反应(multiplex polymerase chain reaction)方法,检测手足口病患者粪便、咽拭子标本中的肠道病毒(Pan-enterovirus,PE)、肠道病毒71型(Enterovirs71ev71)和柯萨奇病毒A组16型(Coxsachie virus,CoxA16)。方法设计3对寡核苷酸引物,分别在同一体系中扩增PE、ev71及CoxA16特异性基因片段,优化反应体系,测定该方法的灵敏性,并用乙型脑炎病毒、轮状病毒、单纯疱疹病毒Ⅰ、Ⅱ型检测其特异性。结果对临床标本作多重PCR检测,ev71(+)标本可见264bp和440bp两条特异性条带,CoxA16(+)标本可见440p、550bp两条特异性条带,PE(+)ev71(-)CoxA16(-)标本可见440bp1条特异性条带。病毒cDNA最低检出浓度分别为4.78、2.36和43.27μg/ml。提取乙型脑炎病毒、轮状病毒、单纯疱疹病毒Ⅰ、Ⅱ型核酸,进行同体系、同条件多重PCR扩增,均为阴性。结论多重PCR方法能在一个反应体系和反应条件下同时检测PE、ev71、CoxA16,且特异性强,灵敏度高,可用于手足口病的临床诊断和流行病学调查。

摘要：目的制备地高辛标记基因探针,利用分子杂交试验同时检测手足口病患者粪便标本中的肠道病毒(Pan-enterovirus,PE)、肠道病毒71型(Enterovirs 71ev71)和柯萨奇病毒A组16型(Coxsachie virus,CoxA16)。方法根据GenBank已发表的基因序列,分别在PE、ev71、CoxA16保守区设计3对特异性寡核苷酸引物,进行实时荧光定量PCR检测。从PE、ev71、CoxA16阳性标本中分离病毒,提取RNA,以RT-PCR扩增产物作为基因探针的目的基因,采用随机引物法进行Digxigenin-11-dUTP标记,采用分子杂交试验检测3种基因探针的灵敏性和特异性。结果 RTPCR分别扩增出116、226、208bp目的基因片段,经标记后作为检测PE、ev71、CoxA16的3种高纯度的基因探针,对相应病毒RNA的最低检出限均为1pg,可分别与PE(+)、ev71(+)、CoxA16(+)标本提取的RNA发生特异性杂交,与乙型脑炎病毒、诺如病毒、轮状病毒、H3N2、甲型H1N1流感病毒的核酸无杂交反应。结论制备的PE、ev71及CoxA16基因探针灵敏、特异,操作简单,适用于手足口病病原的实验室检测。

摘要：目的:建立一步法荧光定量RT-PCR方法快速检测肠道病毒ev71。方法:从Genebank中找出最近2-3年中国大陆区域流行的ev71病毒VP1基因的序列进行比对,找出2-3个相对保守区域设计引物及taqman探针。筛选出一套表现良好的引物并进行反应条件的优化。结果:筛选出一套对ev71病毒具有高度灵敏度和特异性的引物及taqman探针,检测灵敏度达10copiesVP1/μL,整个操作过程仅需2-3h。结论:该套引物及探针针对ev71具有良好特性,是用于ev71的日常监测和暴发时的应急诊断。

摘要：目的研制一种能同时检测ev71，CA16肠道病毒的二联实时荧光定量PCR检测试剂盒，主要用于ev71，CA16肠道病毒的快速检测和流行病学监测。方法设计特异度的ev71型、CA16型基因的引物和探针，优化实时荧光定量PCR检测体系，并研究产品的灵敏度、精密度、稳定性和检测线性范围；同时对2014年5月份收集的26份样品进行检测。结果试验得到了阳性重组质粒，线性范围在5＊10^2 copies／μl-10^5 copies／μl，该范围内检测结果良好；优化后肠道病毒CA16上下游引物和探针浓度分别为0．48，0．24μmol／L，ev71上下游引物和探针浓度分别为0.40，0．20μmol／L。敏感度达到500copies／μl，重复性变异系数CV≤5％；该荧光定量PCR检测试剂盒稳定性强，在-20℃下可以保存一年，对ev71，CA16肠道病毒具有良好的特异度。用该方法检测20份临床阳性样品和6份阴性样品，阳性检出率为100％（20／20），阴性检出率为100％（6／6）。结论试验建立的ev71，CA16肠道病毒实时荧光定量RT—PCR检测方法可用于ev71，CA16肠道病毒的临床诊断。

摘要：目的建立-种可以同时检测ev71、CA16和肠道病毒通用型的三重荧光RT-PCR检测方法,为手足口病监测与应急诊断提供高通量快速检测技术.方法分别在VP1和5’ UTR基因保守区设计ev71、CA16和肠道病毒通用型的特异性检测引物以及Taqman探针,建立并评估三重荧光RT-PCR技术的特异性和敏感性,并对91份疑似手足口病患儿临床标本进行核酸检测与效果验证.结果建立的三重荧光RT-PCR技术可同时对ev71、CA16和肠道病毒通用型进行特异性检测区分,敏感性均可达到0.1TCID50/mL,从核酸提取至完成检测仅需2～3h.91份疑似手足口病患儿临床标本采用三重荧光RT-PCR方法检测,ev71、CA16和其他型别肠道病毒的检出率分别为30.77%、9.89%和5.49%;荧光RT-PCR方法的检出率高于培养分离法.结论建立的三重荧光RT-PCR技术能同时准确分型ev71、CA16和其他型别肠道病毒.

摘要：目的对4例疑似手足口病患儿的肛拭子标本进行ev71的分离与鉴定。方法采集患儿不同病程肛拭子17份接种Hela细胞,盲传3代,观察细胞病变;提取RNA,逆转录,设计三对肠道病毒特异性引物PCR扩增细胞培养物上清中的ev71,分离鉴定。结果具体样本均能引起Hela细胞产生CPE;细胞培养前肛拭子ev71的RT-PCR阳性检出率为52.9%(9/17),培养后细胞上清的阳性检出率为88.2%(15/17);4例患儿全部诊断为肠道病毒ev71感染引起的手足口病。结论病毒分离和核酸检测的联合应用能为肠道病毒ev71的临床诊断提供有力依据;通过病毒分离能提高ev71的核酸检测的阳性率。

摘要：目的 探讨ev71病毒2B基因对ev71病毒诱导细胞凋亡的影响.方法 设计、合成靶向ev71病毒2B基因的siRNA,PCR验证干扰效果,筛选最优siRNA浓度;易感非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)转染后接种ev71病毒,通过普通显微镜下细胞形态观察、细胞存活率测定、培养上清病毒滴度测定验证2B基因siRNA对病毒感染的抑制作用;通过流式细胞术检测细胞周期变化;通过Western blotting检测Caspase 3等凋亡蛋白,探讨凋亡通路上关键蛋白的改变.结果 靶向ev71病毒2B基因的siRNA在100 nM浓度下具有最优的基因沉默效果,ev71病毒感染前经转染处理的细胞存活率增高、上清病毒滴度降低、细胞周期阻滞减轻、凋亡蛋白Caspase 3激活减少(均P<0.05).结论 ev71病毒2B基因siRNA通过Caspase 3信号通路抑制病毒诱导的细胞凋亡.

摘要：目的研究民族药地板藤中总黄酮最佳提取工艺及其对ev71病毒的抑制作用。方法单因素试验确定考察因素及水平,采用Box-Behnken响应面法,用总黄酮得率为指标确定最佳提取工艺。体外抗病毒实验确定地板藤总黄酮抗ev71病毒效果。结果地板藤中总黄酮的最佳提取工艺条件为提取温度50℃,料液比1∶40(g/ml),乙醇浓度55.4249%,提取时间1.5h。在此条件下地板藤黄酮得率为1.169%。地板藤黄酮在体外抗病毒实验中对ev71病毒表现出较好抑制作用。结论该法优化下地板藤总黄酮得率可以达到最优,且总黄酮具有一定体外抗ev71病毒的活性。

摘要：目的:构建ev71基因的原核表达载体,并在原核细胞中进行表达与纯化。方法:根据已知ev71全长核酸序列设计引物,用PCR方法扩增VP1、VP2、VP3和VP4四个基因片段,对目的基因进行酶切并克隆至pET-14b原核表达载体中,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达;所获得的不可溶性蛋白经尿素裂解超声,亲和层析纯化,用SDS-PAGE检测表达产物。结果:测序证实原核重组质粒构建成功;可表达高纯度的四个蛋白,且蛋白大小与预计值相符。结论:成功构建了手足口病主要致病原肠道病毒71型(ev71)的四个衣壳蛋白VP1、VP2、VP3和VP4的原核表达载体,并纯化得到高纯度的四个蛋白,为进一步研究手足口病致病机制奠定了基础。