摘要：树鼩是灵长类动物的近亲,且具有体型小、繁殖周期短、饲养管理成本低等优点,长期以来被认为有望替代灵长类动物用于人类疾病的动物模型研究。该文研究了肠道病毒ev71对幼年中缅树鼩的感染特点,探索建立ev71感染树鼩动物模型及替代灵长类动物的可行性。实验分别采用灌胃、滴鼻和尾静脉注射3种方式,感染3月龄树鼩,定期观察动物临床症状和血常规变化和定期采集血液和粪便样品,并使用中和抗体试验、reverse transcription-PCR(RT-PCR)和Real-TimePCR等技术,检测相关样品中和抗体效价、病毒核酸及载量变化。结合组织病理学检查,分析感染病变特点。研究结果发现,实验组树鼩体温在第4天前后开始升高,白细胞、淋巴细胞也有类似趋势;3种攻毒方式均可检测到病毒载量,峰值出现在第10天前后,灌胃途径尤为明显,血清的最大中和抗体效价为1:16。感染ev71病毒的树鼩2周左右出现急性松弛性瘫痪,大体解剖发现伴有尿潴留症状,组织病理学检查发现在脑、肺、肠、脾脏、肾脏等部位发生病变。结果表明,ev71病毒通过灌胃、滴鼻和静脉注射3种方式均可以感染中缅树鼩,并使之出现神经系统及相关病变,该实验为将来研究ev71感染树鼩致病机理、建立手足口病树鼩动物模型奠定了理论基础。

摘要：目的检测单种及2种联合靶向ev71病毒衣壳蛋白VP1、VP2、VP3、VP4基因（VP1～VP4）的shRNA干扰病毒复制的效果。方法靶向ev71病毒的VP1～VP4基因序列设计及合成shRNA，并分别将其克隆到慢病毒质粒表达载体***中。重组表达质粒同psPAX2和pMD2．G共转染293T细胞，3d后收集上清中的重组病毒颗粒。用荧光定量RT—PCR法（real—timeqRT—PCR）和Westernblot检测单种及2种联合shRNA干扰ev71mRNA的表达水平及病毒蛋白的表达水平。结果靶向ev71VP1-VP4基因的shRNA对本研究的毒株（含死亡病例、重症病例、普通病例，FY0805）复制干扰差异无统计学意义（P〉0．05），对ev71病毒的抑制率分别约为：sh-VP1—1（51．6％），sh—VP1—2（85．1％），sh—VP1-3（76．4％），sh-VP2—1（57．5％），sh-VP2-2（81．4％），sh—VP2-3（79．5％），sh—VP3（68．9％），sh—VP4（56．7％），且有剂量依赖性。干扰病毒效率最高的为sh—VP1-2联合sh—VP2—2，抑制率可达96．6％，联合组均比单种加倍剂量的抑制率高。结论本研究设计的单独及联合靶向ev71病毒衣壳蛋白每个基因区均筛选到抑制率均大于50％的shRNA，且联合shRNA可以增强其干扰复制的能力。

摘要：目的建立多重聚合酶链反应(multiplex polymerase chain reaction)方法,检测手足口病患者粪便、咽拭子标本中的肠道病毒(Pan-enterovirus,PE)、肠道病毒71型(Enterovirs71ev71)和柯萨奇病毒A组16型(Coxsachie virus,CoxA16)。方法设计3对寡核苷酸引物,分别在同一体系中扩增PE、ev71及CoxA16特异性基因片段,优化反应体系,测定该方法的灵敏性,并用乙型脑炎病毒、轮状病毒、单纯疱疹病毒Ⅰ、Ⅱ型检测其特异性。结果对临床标本作多重PCR检测,ev71(+)标本可见264bp和440bp两条特异性条带,CoxA16(+)标本可见440p、550bp两条特异性条带,PE(+)ev71(-)CoxA16(-)标本可见440bp1条特异性条带。病毒cDNA最低检出浓度分别为4.78、2.36和43.27μg/ml。提取乙型脑炎病毒、轮状病毒、单纯疱疹病毒Ⅰ、Ⅱ型核酸,进行同体系、同条件多重PCR扩增,均为阴性。结论多重PCR方法能在一个反应体系和反应条件下同时检测PE、ev71、CoxA16,且特异性强,灵敏度高,可用于手足口病的临床诊断和流行病学调查。

摘要：目的制备地高辛标记基因探针,利用分子杂交试验同时检测手足口病患者粪便标本中的肠道病毒(Pan-enterovirus,PE)、肠道病毒71型(Enterovirs 71ev71)和柯萨奇病毒A组16型(Coxsachie virus,CoxA16)。方法根据GenBank已发表的基因序列,分别在PE、ev71、CoxA16保守区设计3对特异性寡核苷酸引物,进行实时荧光定量PCR检测。从PE、ev71、CoxA16阳性标本中分离病毒,提取RNA,以RT-PCR扩增产物作为基因探针的目的基因,采用随机引物法进行Digxigenin-11-dUTP标记,采用分子杂交试验检测3种基因探针的灵敏性和特异性。结果 RTPCR分别扩增出116、226、208bp目的基因片段,经标记后作为检测PE、ev71、CoxA16的3种高纯度的基因探针,对相应病毒RNA的最低检出限均为1pg,可分别与PE(+)、ev71(+)、CoxA16(+)标本提取的RNA发生特异性杂交,与乙型脑炎病毒、诺如病毒、轮状病毒、H3N2、甲型H1N1流感病毒的核酸无杂交反应。结论制备的PE、ev71及CoxA16基因探针灵敏、特异,操作简单,适用于手足口病病原的实验室检测。

摘要：目的:优化金樱子多糖提取工艺,研究金樱子多糖的体外抗病毒活性。方法:采用Design Expert数据处理软件进行响应面实验设计,确定金樱子多糖最佳超声提取工艺,醇沉法和Sevage-酶法纯化多糖;采用细胞体外抗病毒实验法,结合CPE法及CCK-8试剂盒,研究金樱子多糖对呼吸道合胞病毒(RSV)、柯萨奇病毒(COX-B5)、手足口病病毒(ev71)的抑制作用。结果:金樱子多糖超声提取的最佳工艺条件为:提取温度74℃,超声时间49 min,液料比25 m L/g,测得多糖提取率15.084%;多糖纯化后含量为84.58%,且抗RSV和COX-B5的效果优于阳性对照药利巴韦林,其TI值分别为80.895、41.541。结论:在使用响应面软件的优化下,金樱子多糖的提取率可以达到最高,且金樱子多糖具有体外抗RSV、ev71、COX-B5的活性。

摘要：目的:构建人肠道病毒71型(human enterovirus 71,ev71)VP1-VP4重组融合蛋白表达体系.方法:构建ev71 VP1-VP4重组融合蛋白原核表达载体转化大肠杆菌DH5α,诱导表达融合蛋白VP1-VP4,SDS-PAGE和Western blot法进行鉴定.用融和蛋白包被ELISA板检测41例已知血清.结果:重组片段VP1-VP4测序结果与设计目的片段序列相符,重组载体构建成功;SDS-PAGE显示融合蛋白约42.8kDa,与预期值一致;Westernblot提示该融合蛋白可以和ev71 VP1、VP4抗体特异性结合.融合蛋白包被ELISA板能准确检测出41例血清中16例ev71阳性血清,与CA16无交叉反应.结论:表达的ev71 VP1-VP4融合蛋白具有良好的抗原性,可作为ev71感染检测抗原,为ev71诊断试剂和疫苗的研究奠定实验基础.

摘要：目的建立-种可以同时检测ev71、CA16和肠道病毒通用型的三重荧光RT-PCR检测方法,为手足口病监测与应急诊断提供高通量快速检测技术.方法分别在VP1和5’ UTR基因保守区设计ev71、CA16和肠道病毒通用型的特异性检测引物以及Taqman探针,建立并评估三重荧光RT-PCR技术的特异性和敏感性,并对91份疑似手足口病患儿临床标本进行核酸检测与效果验证.结果建立的三重荧光RT-PCR技术可同时对ev71、CA16和肠道病毒通用型进行特异性检测区分,敏感性均可达到0.1TCID50/mL,从核酸提取至完成检测仅需2～3h.91份疑似手足口病患儿临床标本采用三重荧光RT-PCR方法检测,ev71、CA16和其他型别肠道病毒的检出率分别为30.77%、9.89%和5.49%;荧光RT-PCR方法的检出率高于培养分离法.结论建立的三重荧光RT-PCR技术能同时准确分型ev71、CA16和其他型别肠道病毒.

摘要：目的研制一种能同时检测ev71，CA16肠道病毒的二联实时荧光定量PCR检测试剂盒，主要用于ev71，CA16肠道病毒的快速检测和流行病学监测。方法设计特异度的ev71型、CA16型基因的引物和探针，优化实时荧光定量PCR检测体系，并研究产品的灵敏度、精密度、稳定性和检测线性范围；同时对2014年5月份收集的26份样品进行检测。结果试验得到了阳性重组质粒，线性范围在5＊10^2 copies／μl-10^5 copies／μl，该范围内检测结果良好；优化后肠道病毒CA16上下游引物和探针浓度分别为0．48，0．24μmol／L，ev71上下游引物和探针浓度分别为0.40，0．20μmol／L。敏感度达到500copies／μl，重复性变异系数CV≤5％；该荧光定量PCR检测试剂盒稳定性强，在-20℃下可以保存一年，对ev71，CA16肠道病毒具有良好的特异度。用该方法检测20份临床阳性样品和6份阴性样品，阳性检出率为100％（20／20），阴性检出率为100％（6／6）。结论试验建立的ev71，CA16肠道病毒实时荧光定量RT—PCR检测方法可用于ev71，CA16肠道病毒的临床诊断。

摘要：目的:建立一步法荧光定量RT-PCR方法快速检测肠道病毒ev71。方法:从Genebank中找出最近2-3年中国大陆区域流行的ev71病毒VP1基因的序列进行比对,找出2-3个相对保守区域设计引物及taqman探针。筛选出一套表现良好的引物并进行反应条件的优化。结果:筛选出一套对ev71病毒具有高度灵敏度和特异性的引物及taqman探针,检测灵敏度达10copiesVP1/μL,整个操作过程仅需2-3h。结论:该套引物及探针针对ev71具有良好特性,是用于ev71的日常监测和暴发时的应急诊断。

摘要：目的研究民族药地板藤中总黄酮最佳提取工艺及其对ev71病毒的抑制作用。方法单因素试验确定考察因素及水平,采用Box-Behnken响应面法,用总黄酮得率为指标确定最佳提取工艺。体外抗病毒实验确定地板藤总黄酮抗ev71病毒效果。结果地板藤中总黄酮的最佳提取工艺条件为提取温度50℃,料液比1∶40(g/ml),乙醇浓度55.4249%,提取时间1.5h。在此条件下地板藤黄酮得率为1.169%。地板藤黄酮在体外抗病毒实验中对ev71病毒表现出较好抑制作用。结论该法优化下地板藤总黄酮得率可以达到最优,且总黄酮具有一定体外抗ev71病毒的活性。