摘要：目的 探讨ev71病毒2B基因对ev71病毒诱导细胞凋亡的影响.方法 设计、合成靶向ev71病毒2B基因的siRNA,PCR验证干扰效果,筛选最优siRNA浓度;易感非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)转染后接种ev71病毒,通过普通显微镜下细胞形态观察、细胞存活率测定、培养上清病毒滴度测定验证2B基因siRNA对病毒感染的抑制作用;通过流式细胞术检测细胞周期变化;通过Western blotting检测Caspase 3等凋亡蛋白,探讨凋亡通路上关键蛋白的改变.结果 靶向ev71病毒2B基因的siRNA在100 nM浓度下具有最优的基因沉默效果,ev71病毒感染前经转染处理的细胞存活率增高、上清病毒滴度降低、细胞周期阻滞减轻、凋亡蛋白Caspase 3激活减少(均P<0.05).结论 ev71病毒2B基因siRNA通过Caspase 3信号通路抑制病毒诱导的细胞凋亡.

摘要：目的:构建ev71基因的原核表达载体,并在原核细胞中进行表达与纯化。方法:根据已知ev71全长核酸序列设计引物,用PCR方法扩增VP1、VP2、VP3和VP4四个基因片段,对目的基因进行酶切并克隆至pET-14b原核表达载体中,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达;所获得的不可溶性蛋白经尿素裂解超声,亲和层析纯化,用SDS-PAGE检测表达产物。结果:测序证实原核重组质粒构建成功;可表达高纯度的四个蛋白,且蛋白大小与预计值相符。结论:成功构建了手足口病主要致病原肠道病毒71型(ev71)的四个衣壳蛋白VP1、VP2、VP3和VP4的原核表达载体,并纯化得到高纯度的四个蛋白,为进一步研究手足口病致病机制奠定了基础。

摘要：目的对4例疑似手足口病患儿的肛拭子标本进行ev71的分离与鉴定。方法采集患儿不同病程肛拭子17份接种Hela细胞,盲传3代,观察细胞病变;提取RNA,逆转录,设计三对肠道病毒特异性引物PCR扩增细胞培养物上清中的ev71,分离鉴定。结果具体样本均能引起Hela细胞产生CPE;细胞培养前肛拭子ev71的RT-PCR阳性检出率为52.9%(9/17),培养后细胞上清的阳性检出率为88.2%(15/17);4例患儿全部诊断为肠道病毒ev71感染引起的手足口病。结论病毒分离和核酸检测的联合应用能为肠道病毒ev71的临床诊断提供有力依据;通过病毒分离能提高ev71的核酸检测的阳性率。

摘要：手足口病是由人肠道病毒引起的一种儿童常见传染病,主要由肠道病毒71型和柯萨奇病毒A组16型引起。近年来,尤其是肠道病毒71引发的手足口病在亚太地区呈上升趋势。本研究采用RT-PCR技术,设计特异性引物扩增ev71 VP1基因序列,克隆至原核表达载体p ET32a(+)中,以期为今后肠道病毒ev71新型疫苗的开发提供技术基础。

摘要：目的获得ev71P1保守氨基酸序列COBRA ev71 P1和基于此序列的B细胞抗原表位预测信息。方法从NCBI(http://***/)上下载获取1970-2010年间世界各地暴发流行的包含P1或VP1基因片段的ev71源序列和对应的氨基酸序列,根据VP1基因片段信息构建系统进化树,对源序列进行基因分组;对多基因型的ev71 P1氨基酸源序列采用多序列比对,以优势氨基酸位点代替差异氨基酸位点的方法,获得ev71 P1保守序列(COBRA ev71 P1),并运用IEDB Analysis Resource (http://***/main/)在线预测工具和DNASTAR软件里的Protean模块,运用单参数和二级结构预测综合考虑的方法,对COBRA ev71 P1前体蛋白的B细胞抗原表位进行预测。结果成功比对出COBRA ev71 P1氨基酸序列,预测结果发现在COBRA ev71 P1前体蛋白的第10-24,41-60,68-82,208-225,328-345,498-514,592-609,664-678,772-786和841-855位点均具有较好的亲水性、表面可及性、柔韧性和抗原指数,并且在二级结构上含有易形成抗原表位的无规则卷曲和β-转角,有可能是COBRA ev71 P1前体蛋白的优势表位。结论经生物信息学分析,推测COBRA ev71 P1可能具有三个基因型ev7 1P1前体蛋白的候选B细胞线性抗原表位,为ev71重组多表位疫苗设计和多基因型病毒样颗粒疫苗实验提供了理论基础。

摘要：[目的]肠道病毒71(Enterovirus 71,ev71)是引发手足口病(Hand-foot-mouth Disease,HFMD)的主要病原体之一,为了筛选ev71抗原表位,开发新型ev71疫苗,利用优化后的PCR点突变技术定点突变ev71 VP1基因。[方法]设计含有突变位点的互补引物,模板使用量为10 ng,进行单引物PCR,将PCR产物混合后复性,转化至大肠杆菌BL21,筛选阳性克隆并测序。[结果]测序结果表明VP1基因突变率为40%～45%。[结论]该方法对传统的PCR点突变技术进行改进,降低模板使用量,使用单引物PCR,省略DpnⅠ酶解过程,可达到40%～45%的定点突变率,从而降低实验成本、简化操作流程。

摘要：目的建立一种能同时检测发热伴出疹症候群中的肠道病毒71(ev71)、柯萨奇病毒A组16(CA16)和麻疹病毒(MV)的高通量液相芯片检测方法。方法针对ev71、CA16和MV全基因组序列,分别设计特异性引物和探针,经多重PCR扩增并用生物素标记相应的基因片段,建立ev71、CA16和MV高通量核酸液相芯片检测方法。并对该方法灵敏度、特异度进行验证。结果液相芯片检测方法对ev71、CA16和MV的检测结果与多重PCR的检测结果一致。该方法能同时完成对其中任何1种及3种病毒的检测,特异性好,灵敏度最低可达2.14pg/μl。结论该方法用于3种发热伴出疹症候群病毒的检测具有较高的灵敏度和特异性,可用于ev71、CA16和MV的实验室检测。