摘要：目的:完成钝尾毒蜥exendin-4基因在大肠杆菌中的串联高效表达。方法:按照大肠杆菌偏爱密码子设计exendin-4基因片段,利用同尾酶构建多拷贝串联的表达载体,于大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,SDS-PAGE鉴定结果,表达产物Ni柱纯化后肠激酶切割,高效液相色谱及四级杆-飞行时间质谱纯化、鉴定,确定目标产物,作用胰岛瘤细胞INS-1检测胰岛素释放活性。结果:成功构建重组载体pET28a-(exendin-4)n(n=2,4,6),且均获得可溶性表达产物,重组表达蛋白经切割、纯化、鉴定和制备,最终得到纯度98%的exendin-4,其具有与标准品相似的促葡萄糖刺激的胰岛素释放活性。结论:试验成功利用串联表达方式制备有活性的exendin-4,为下一步2型糖尿病治疗药物的研究奠定了基础。

摘要：针对exendin-4的螺旋结构特点,采用去掉螺旋序列、用3个连续Ala替换螺旋以及Gln13替换为Tyr13的方式对N端α-螺旋及C端α-螺旋进行改造,设计出4个结构模拟物.通过圆二光谱和荧光光谱进行结构分析,结合模拟物生物活性实验,分析exendin-4螺旋结构与生物活性的关系.结果表明:exendin-4的N端螺旋比C端螺旋对生物活性影响更大;在抗二肽基肽酶(DPPⅣ酶)的稳定性实验中,C端螺旋比N端螺旋具有更好维系exendin-4稳定性的作用;螺旋结构中Tyr13可作为提高exendin-4生物活性的重要优化位点.

摘要：为了制备GST-exendin-4融合蛋白,以本实验室构建好的pET22b-exendin-4为模板,通过PCR扩增出exendin-4基因,酶切克隆入pGEX-4T-1,构建重组表达质粒pGEX-4T-1-exendin-4。经DNA测序证实插入序列与设计完全一致后,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),在不同浓度的IPTG和不同温度诱导下,经SDS-PAGE分析鉴定,表达出Mr约为30 kD的目的蛋白,灰度扫描显示目的蛋白占菌体总蛋白的29.9%,超声裂解后的上清通过Sepharose 4B亲和层析纯化、透析、除盐及冷冻干燥得到高纯度的目的蛋白。本研究成功制备了高纯度的GST-exendin-4融合蛋白,为下一步进行目的蛋白大规模的生产打下了良好的基础。

摘要：根据GenBank中已公布的编号为AAB2200的exendin-4氨基酸片断,及酵母密码子偏好性,设计了exendin-4在酵母中的表达序列。利用基因工程技术,将编码exendin-4的蛋白基因亚克隆到含有分泌信号肽序列的毕赤酵母表达载体pPIC9K中,构建成分泌型重组表达栽体pPIC9K-E4。用电转化法将线性化的pPIC9K-E4转化入毕赤酵母菌株GSll5,转化子经MD平板筛选,得到的阳性菌株再用浓度梯度递增的G418筛选多拷贝重组子。将MM和MD平板筛选得到Muts菌株用甲醇诱导表达6d,每隔24h取样。Tricine-SDS-PAGE检测结果显示,诱导后第6天表达量达到最高。

摘要：exendin-4是一种新型GLP-1类似物,已被用于2型糖尿病的治疗。由于其优良的药学特性成为糖尿病治疗的亮点,而进一步开发设计长效exendin-4药物成为近年2型糖尿病药物研究的热点。本文就长效exendin-4药物的国内外研究进展、作用机制以及药效学性质做一综述。

摘要：目的克隆exendin-4 39肽氨基酸序列基因编码区cDNA。方法根据exendin-4氨基酸序列编码cDNA,设计正、负向引物/模板链,利用重叠延伸PCR法扩增出exendin-4编码区基因DNA片段;将获得的基因片段插入pGEM-T-Easy质粒中;转化到大肠杆菌DH5α后挑选阳性克隆,利用限制性内切酶及核苷酸序列分析技术鉴定重组质粒。结果经质粒DNA酶切分析及序列测定,获得了exendin-4 DNA片段序列。结论本研究成功克隆了exendin-4 cDNA,为下一步构建exendin-4真核表达载体打下基础,也为exendin-4基因治疗糖尿病提供了前提条件。