摘要：目的探讨膜-细胞骨架联接蛋白ezrin对胃癌细胞株AGS侵袭和迁移能力的影响。方法针对人Villin2基因(ezrin编码基因)设计发夹式RNA(shRNA)。合成后克隆入载体pGCsilencer,扩增并中量提取质粒,应用脂质体Lipofectamine2000转染进AGS细胞。采用RT-PCR和Western印迹检测ezrin的表达。shRNA转染AGS细胞并行G418筛选,传代扩增。结果shRNA-ezrin对ezrin表达抑制作用明显,稳定转染细胞ezrin下调率达93%。侵袭实验AGSezrin细胞的跨膜数为(27.67±4.50),与对照组(125.50±8.33)比较差异具有统计学意义(P<0.01)。结论ezrin在人胃癌细胞侵袭迁移过程中发挥重要作用,可能成为胃癌基因治疗的一个新靶点。

摘要：目的探讨膜-细胞骨架联接蛋白ezrin对肾癌细胞株786-0细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响。方法以ezrin为靶基因,以Pgenesil-1质粒为载体设计和构建重组体,设计2条发夹式RNA(shRNA),合成后克隆入载体Pgenesil-1,脂质体Lipofectamine2000转染进786-0细胞,观察RNA干扰ezrin后肾癌细胞株786-0细胞增殖及侵袭能力的改变。结果稳定转染细胞荧光定量PCR结果显示shRNA-ezrin1对ezrin mRNA的表达量抑制率66.33%,稳定转染细胞ezrin下调率达93%,shRNA干扰后786-0细胞增殖活性减弱,GO/G1时段明显延长(P<0.01),PI缩短(P<0.01),细胞凋亡率增加(P<0.01);细胞黏附力减弱,细胞运动、穿孔能力减弱(P<0.01)。结论 RNA干扰ezrin可有效抑制786-0细胞增殖活性、降低细胞的侵袭力,ezrin在人肾癌细胞增殖、侵袭中发挥重要作用。

摘要：目的探讨膜-细胞骨架联接蛋白ezrin对骨肉瘤细胞株UMR106成瘤及转移能力的影响。方法为获得较好的干扰效果,针对大鼠Villin2基因(ezrin编码基因)设计2个发夹式RNA(shRNA)。合成后克隆入载体pGenSil-1,扩增并中量提取质粒,应用脂质体LipofectamineTM 2000转染进UMR106细胞。采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和West-ern印迹检测ezrin的表达。选取效果最好的shRNA转染UMR106细胞并行G418筛选,传代扩增。扩增后细胞原位接种到SD大鼠胫骨结节,并设立正常细胞组和阴性对照组,观察记录肿瘤形成和大鼠存活时间,计数肺表面转移灶数目,镜检定位增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescence protein,EGFP)在原发灶和肺转移灶内的表达。结果①shRNA1干扰作用最明显,下调达90%。②移植时稳定转染细胞数约50%。③实验组与对照组均100%成瘤,成瘤时间正常细胞组为(10.25±1.07)d,阴性对照组为(10.08±0.88)d,实验组为(10.30±1.08)d,三者间没有明显差别(P>0.05);实验组存活时间(42.30±17.25)d明显长于正常细胞组(20.60±11.70)d(P<0.01)和阴性对照组(22.40±7.42)d(P<0.01);实验组肺转移灶数目明显低于正常细胞组(P<0.01)和阴性对照组(P<0.01),分别为(39.40±51.86)个、(124.60±39.78)个和(117.60±36.48)个;阴性对照组中原发灶和肺转移灶内均有EGFP表达,而实验组肺转移灶内未见EGFP表达。结论ezrin蛋白是骨肉瘤肺转移中的一个关键因子,干扰ezrin蛋白表达能抑制其肺转移的发生,可以作为预防肺转移的靶点。

摘要：目的:设计并构建能有效下调ezrin蛋白表达的短发夹状RNA(Small hairpin RNAs,hRNA)表达载体,探讨载体介导的RNA干扰技术用于预防性治疗骨肉瘤肺转移的可行性。方法:依据小干扰RNA(Small interfering RNAs,iRNA)靶序列的设计原则,以ezrin蛋白编码基因Villin2为靶基因,合成两对编码短发卡结构的两条DNA序列,经退火合成DNA双链,再克隆至shRNA表达载体pGenesil-1质粒中,转化后进行酶切鉴定和DNA序列测定。将构建的载体用脂质体介导转染大鼠骨肉瘤UMR106细胞株,采用RT-PCR和Western blot法检测细胞ezrin蛋白在mRNA和蛋白水平的表达。结果:成功构建2个针对ezrin蛋白的shRNA表达载体;其转染大鼠骨肉瘤UMR106细胞后,细胞ezrin蛋白表达在mRNA及蛋白水平上的表达均显著下降。结论:ezrin蛋白的shRNA表达载体能显著抑制大鼠骨肉瘤UMR106细胞ezrin蛋白的表达,本研究为预防性治疗骨肉瘤肺转移的实验奠定基础。

摘要：目的:构建膜-细胞骨架联接蛋白ezrin基因特异性短发卡RAN表达载体(small hairpin RNA,shRNA),探讨其对肾癌细胞株786-0细胞凋亡、增殖的影响。方法:以ezrin为靶基因,以Pgenesil-1质粒为载体,设计和构建重组体,设计2条发夹式RNA(shRNA),合成后克隆入载体Pgenesil-1,扩增并中量提取质粒,应用脂质体Lipofectamine 2000转染进786-0细胞,重组质粒转染786-0肾癌细胞株,用运实时荧光定量PCR进行筛选鉴定,筛选出抑制率较高的重组质粒载体shRNA-ezrin1,用shRNA-ezrin1转染786-0细胞,采用MTT、流式细胞仪、电镜检测,观察RNA干扰ezrin后肾癌细胞株786-0细胞增殖能力的改变。结果:shRNA干扰后786-0细胞增殖活性减弱,G0/G1时段明显延长(P<0.01),PI缩短(P<0.01),细胞凋亡率增加(P<0.01)。结论:ezrin与肾癌细胞凋亡、增殖有关,有望成为肾癌基因治疗的一个新靶点。