摘要：旨在建立双重实时荧光定量PCR(RT-qPCR)方法,对叉头框蛋白P3(foxp3)、白细胞介素10(IL-10)的RNA转录进行定量检测。设计并合成foxp3、IL-10的扩增引物和荧光探针,优化引物浓度、退火温度,建立RT-qPCR方法,检测猪圆环病毒2型(PCV2)感染外周血调节性T淋巴细胞(Treg)和免疫器官中foxp3和IL-10的mRNA含量;根据Western blot检测蛋白表达验证方法的可靠性。结果:建立的RT-qPCR方法呈现“S”型扩增曲线,相关系数R^(2)≥0.99;转化生长因子-β(TGF-β)、干扰素-γ(IFN-γ)、白细胞介素2(IL-2)、白细胞介素4(IL-4)、白细胞介素6(IL-6)和白细胞介素17(IL-17)等基因的核酸模板和阴性对照均无扩增曲线,最低检测浓度10 copies/μL,批内、批间变异系数分别为0.87%、1.84%;PCV2攻毒组外周血Treg细胞中foxp3和IL-10的mRNA含量均出现明显升高,foxp3的mRNA含量在攻毒第14天到达峰值,IL-10的mRNA含量在攻毒第10天到达峰值,PCV2感染后导致胸腺、淋巴结和脾脏中foxp3和IL-10转录水平升高;Western blot检测表明,foxp3蛋白表达量在攻毒第14天、第28天,IL-10在攻毒第10天和第14天显著高于对照组,与RT-qPCR结果一致。综上,本研究建立的猪foxp3、IL-10双重RT-qPCR方法具有特异、敏感、检测稳定可靠的特点,对于评价猪体的免疫应答水平和机体免疫稳态具有重要意义。

摘要：目的:利用RNA干扰(RNAi)技术在体外干扰小鼠B16黑素瘤细胞foxp3基因表达,探讨RNA干扰用于黑素瘤治疗的可行性。方法:针对foxp3基因设计小干扰RNA(siR-NA),构建起短发夹状RNA(shRNA)慢病毒表达载体,并转染小鼠B16细胞,在体外诱导RNA干扰。分别采用Westernblot和RT-PCR检测foxp3基因的表达情况;ELISA检测TGF-β1、TGF-β2和IL-10等细胞因子的变化;将干扰后的小鼠B16细胞与CD4+CD25-T淋巴细胞共培养,CCK8法检测CD4+CD25-T淋巴细胞增殖能力。结果:通过foxp3 shRNA的转染,可实现对B16细胞foxp3表达的沉默,可下调肿瘤细胞对CD4+CD25-T淋巴细胞增殖抑制的能力,并且下调TGF-β1、TGF-β2和IL-10等细胞因子的表达,尤其是TGF-β2的表达。结论:RNA干扰可抑制小鼠黑素瘤细胞靶基因foxp3的表达及细胞增殖,并对CD4+CD25-T淋巴细胞增殖抑制的能力减弱,同时减弱抑制性细胞因子的分泌,为黑素瘤的基因治疗提供了新思路。

摘要：目的构建Treg(regulatory T cell)细胞关键转录因子foxp3逆转录病毒表达载体,并将其转染和稳定表达于Treg细胞中,检测Treg细胞因子改变。方法设计编码区全长序列引物,Hi Fi PCR(high fidelity reverse transcription polymerase chain reaction)扩增编码区序列。胶回收PCR产物,将PCR产物与线性化p SCV-Bsd RFP质粒连接并测序鉴定。将p SCV-Bsd RFP质粒电转入骨架质粒BJ5183,将其转染293病毒包装细胞体系,包装病毒。反复感染4次得到高滴度p SCV-Bsd RFP-foxp3逆转录病毒液。将此高表达逆转录病毒命名为p SCV-Bsd RFP-foxp3,感染大鼠脾脏来源Treg细胞,G418筛选稳定表达细胞株。ELISA(enzymelinked immunosorbent assay)检测Treg细胞因子IL-10和转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)的改变。结果 Hi Fi PCR得到编码区全长序列DNA,连接到p SCV-Bsd RFP质粒,测序鉴定扩增序列符合编码区序列。p SCV-Bsd RFP质粒成功转染BJ5183后,转染293病毒包装体系,可见感染细胞有红色荧光表达。p SCV-Bsd RFP-foxp3病毒感染Treg细胞稳定表达后,可见细胞内红色荧光表达。IL-10和TGF-β表达增强。结论成功构建foxp3高表达逆转录病毒p SCV-Bsd RFP-foxp3,转染大鼠脾脏来源Treg细胞并得到稳定高表达foxp3的Treg细胞。p SCV-Bsd RFP-foxp3可增强Treg细胞分泌IL-10和TGF-β功能。

摘要：目的:探讨CD4、CD8、foxp3在子宫颈癌新辅助化疗(NACT)前后表达的变化及临床价值。方法:选择上海交通大学医学院附属仁济医院妇产科2013年10月至2017年9月收治的应用NACT的局部晚期(ⅠB2~ⅡB)子宫颈癌患者NACT前后免疫组化检测CD4+、CD8+及foxp3表达的变化,并通过计算机软件进行定量分析其与化疗疗效、无病生存期(PFS)、总体生存期(OS)之间的关系。结果:局部晚期子宫颈癌NACT前后CD4、CD8、foxp3在组织中表达的变化与患者年龄、病灶大小无相关性(P>0. 05),但是CD4、CD8与子宫颈癌FIGO分期呈正相关(P 0. 05),但NACT后CD8表达的增加与患者PFS呈正相关(r=0. 309,P=0. 041),而与CD4(P=0. 581)、foxp3(P=0. 134)无明显关系。患者的OS与CD4、CD8和foxp3化疗前后表达的变化无明显相关性(P> 0. 05)。结论:局部晚期子宫颈癌NACT后,CD4、CD8、foxp3表达较NACT前升高,CD4、CD8表达的变化与肿瘤分期、病理分级相关,而且CD8化疗前后的变化可以作为独立的预后指标。

摘要：目的建立检测人外周血单个核细胞(PBMC)中foxp3mRNA的方法。方法跨内含子设计外引物,并根据扩增的片段,设计一对内引物和TaqM an探针,采用套式实时荧光定量PCR(nested-real-tim e-PCR)方法。首次PCR扩增用减少引物浓度及循环次数的方法以增加其模板的特异性,再行第二次PCR扩增作实时荧光定量检测,用foxp3和β-actin标准品作标准曲线,以二者比值作为foxp3mRNA表达水平指标。结果重复6次PCR,6次试验C t的总平均值为14.66,平均变异系数为5.81%。C t值和模板起始浓度对数值之间具有较好的线性关系(R2=0.999);检测最低浓度可达100拷贝。结论nested-re-al-tim e-PCR检测PBMC中foxp3mRNA的方法简单且重复性好,高度敏感且特异,可作为评价免疫功能及某些疾病治疗效果观察的临床常用方法。

摘要：目的:探讨天然CD25和foxp3抗体在非小细胞肺癌(NSCLC)患者血浆表达变化的临床意义及其作为诊断标志物的潜能。方法:选取青岛大学附属青岛市立医院胸外科首次确诊且未经任何治疗的NSCLC患者200例及同期性别、年龄、吸烟史相匹配的健康志愿者190例,收集两组血液样本。基于CD25及foxp3分子结构,利用表位预测软件(http://***)设计并合成3条线性抗原肽(即CD25a、CD25b、foxp3)并外送化工公司合成,通过自行建立的优化ELISA检测方法,检测NSCLC患者及健康对照组血浆CD25及foxp3抗体的表达水平,并分析CD25及foxp3抗体的表达与临床病理特征之间的关系。同时绘制ROC曲线,评估CD25及foxp3抗体对不同TNM分期NSCLC的诊断价值。结果:NSCLCⅡ~Ⅳ期患者血浆CD25a、foxp3抗体的表达较健康对照组显著增加(0.66±0.18 vs 0.52±0.17,P0.05)。CD25b抗体的表达与性别、年龄、肿瘤分化程度有关(P均0.05),而foxp3抗体的表达仅与肿瘤分化程度有关(P<0.05)。对CD25、foxp3抗体诊断NSCLC的效能评估,CD25a曲线下面积为0.727(95%CI:0.677~0.778),最佳截断值为0.55,敏感度为77%,特异度为64%;CD25b曲线下面积为0.601(95%CI:0.545~0.657),最佳截断值为0.35,敏感度为62%,特异度为57%;foxp3曲线下面积为0.613(95%CI:0.557~0.669),最佳截断值为0.54,敏感度为58%,特异度为65%。结论:检测CD25a天然抗体可辅助NSCLC的早期诊断;血浆CD25b天然抗体在早期NSCLC(Ⅰ+Ⅱ期)表达降低,对预测早期NSCLC有一定价值。

摘要：目的构建foxp3基因的shRNA干扰表达载体,观察foxp3基因表达对人胃癌细胞株BGC-823细胞增殖和凋亡的影响。方法根据人foxp3序列设计并构建foxp3基因的shRNA真核表达载体,利用脂质体LipofactamineTM2000转染胃癌细胞株,经G418筛选出稳定转染的阳性细胞,Real-time PCR检测在mRNA水平干扰质粒对foxp3的抑制效应,MTT法、流式细胞术观察转染后细胞生长特性的变化。结果成功将含靶向foxp3基因的短发夹双链RNA(shRNA)的重组质粒转染foxp3表达阳性的胃癌细胞株BGC-823,转染shRNA-foxp3重组质粒的BGC-823细胞foxp3mRNA表达明显下降,与阴性对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。转染干扰质粒抑制细胞增殖,促进细胞凋亡,与未转染组和阴性对照组相比,胃癌细胞生长周期出现阻滞在G0/G1期,差异有统计学意义(P<0.05)。结论干扰foxp3的表达可显著抑制胃癌细胞的增殖和促进细胞凋亡。

摘要：【目的】筛选高效的foxp3RNA干扰的靶点用于阻断CD4+CD25+Treg细胞的免疫抑制功能。【方法】使用oligoengine软件设计foxp3基因shRNA序列,化学合成法合成4条shRNA序列,构建含foxp3的靶序列的慢病毒载体;构建出表达FLAG融合蛋白和目的基因的工具细胞293T细胞用于筛选RNA干扰的有效靶点。【结果】成功包装了4条foxp3基因靶序列相应的慢病毒颗粒;成功构建了表达融合蛋白和目的基因的293T工具细胞;在工具细胞上筛选出了2条RNAi效率分别为91.3%和95.6%的有效靶点。【结论】使用FLAG融合蛋白和慢病毒载体能够筛选出foxp3基因的RNAi最佳靶点。

摘要：目的探讨降低foxp3的表达对神经母细胞瘤细胞SK—N—BE2免疫功能的影响。方法设计、合成foxp3的siRNA干扰序列，转染神经母细胞瘤细胞SK—N—BE2，分别采用ReM—timePCR及流式细胞术观察foxp3以及共刺激分子CD86在干扰前后的表达；最后将foxp3干扰的SK—N—BE2细胞与人外周血共培养，观察foxp3的不同表达水平对上述培养体系中T淋巴细胞功能的影响。结果本研究设计、合成的siRNA显著降低了foxp3在神经母细胞瘤细胞SK—N-BE2中的表达，低表达foxp3的SK—N—BE2细胞上共刺激分子CD86的表达显著升高，且在共培养体系中细胞因子IFN-γ、IL-17的表达出现轻微上调，但同时显著降低了免疫抑制分子IL-10、TGF—β在mRNA水平的表达。结论foxp3在神经母细胞瘤中的高表达可能是该细胞逃避免疫监视的重要机制，干扰foxp3的表达能降低共培养体系中的免疫抑制分子表达，表明干预该分子可望为肿瘤的免疫防治提供新的思路。

摘要：目的研究foxp3 shRNA对肝癌细胞株SMMC-7721和MHCC-97H的趋化因子及受体CXCL12、CXCL11、CXCR4、CXCR7的影响。方法设计三种编码foxp3 shRNA的foxp3干扰慢病毒,sh-foxp3-1-pGreenPuro、sh-foxp3-2-pGreenPuro和sh-foxp3-pgreenpuro并分别转染SMMC-7721和MHCC-97H细胞。q-PCR检测各组CXCL12、CXCL11、CXCR4、CXCR7 mRNA的表达情况;Western Blot检测各组CXCL12、CXCL11、CXCR4、CXCR7蛋白的表达情况。结果经菌落PCR和测序验证证明三个foxp3干扰慢病毒载体构建正确;三种干扰序列中sh-foxp3-1干扰效果最明显,因此后期实验都使用sh-foxp3-1进行下面的实验。研究显示:(1)与对照组相比,sh-foxp3-1组的CXCL12、CXCL11、CXCR4、CXCR7 mRNA表达明显下降,差异具有统计学意义。(2)与对照组相比,sh-foxp3-1组的CXCL12、CXCL11、CXCR4、CXCR7蛋白表达明显下降,差异具有统计学意义。结论干扰foxp3的表达后,能减少趋化因子CXCL12、CXCL11、CXCR4、CXCR7的表达。