摘要：传染性皮下和造血组织坏死病毒(infectious hypodermal and haematopoietic necrosis virus,IHHNV)是危害虾类健康养殖的重要病原,为寻找一种快捷保存及分离IHHNV DNA的方法,为后续研究提供完整的核酸材料,选用fta(flinders technology associates)卡为保存介质,以fta纯化试剂、TE(Tris-EDTA)缓冲液及去离子水为基础洗脱液,设计7种fta卡黏附DNA洗脱方法,通过荧光定量PCR检测方法检验不同核酸洗脱分离效果及最低的点膜核酸量。结果显示,于4 mm2的fta卡上,点样体积为2.5μL,用洗脱液作为模板时,最低点膜核酸浓度需要1.47×104copies/μL以上,可获得最佳的检测灵敏度和100%检出率的洗膜方法为50μL TE缓冲液于95℃下浸洗5 min;用膜片做模板,点膜核酸浓度需要1.82×103copies/μL以上,室温(20~25℃)条件下,用fta纯化试剂洗脱3次,再用TE缓冲液洗脱2次,洗脱时间均为5 min,可获得最佳的检测灵敏度和100%的准确度。以fta卡保存对虾白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)、虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei,EHP)、虾十足目虹彩病毒1(Decapod iridescent virus 1,DIV1)、偷死野田村病毒(covert mortality noda virus,CMNV)、致急性肝胰腺坏死副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VpAHPND)核酸,测试所建洗脱方法的效果,证实了该方法对其他虾类病原核酸的洗脱具有通用性。该研究给出了fta卡保存和洗脱IHHNV DNA的适用性方案,为野外对虾样品采集、病毒核酸样品跨区域传递的保存和运输条件提供了科学数据。

摘要：用fta采样卡和普通定性滤纸采集藏绵羊血样,采用NaOH法提取血液基因组DNA,利用设计的一对引物对DRB1基因第三外显子进行扩增,通过PCR产物琼脂糖凝胶检测,对普通定性滤纸与fta采样卡的两种提取DNA的方法进行比较,结果认为采用普通定性滤纸-NaOH法提取血液基因组DNA,NaOH的最佳洗涤浓度是25 mmol/L,采用fta-NaOH法提取血液基因组DNA,NaOH的最佳洗涤浓度是20 mmol/L,但普通定性滤纸法提取血液基因组DNA平均成本远低于fta采样卡,普通定性滤纸法提取血液基因组DNA具有快速、便捷、经济及高效的特点。

摘要：目的建立敏感、特异、高效的检测田鼠巴贝虫fta-环介导等温扩增技术(LAMP)。方法根据GenBank公布的田鼠巴贝虫基因序列,就细胞色素B基因保守序列设计了多套LAMP引物,利用LAMP RealTime Turbidimeter LA-320仪筛选最佳引物、反应条件,建立LAMP检测方法,从保存有血液样本的fta卡片中提取田鼠巴贝虫DNA进行LAMP,观察检测效果。结果设计的4组引物做LAMP试验,其中以引物1,最佳反应温度为64℃,恒温下作用,敏感性高,可在1h内完成,其检出限量为0.687fg/μL,而PCR的最低检测量为0.687pg/μL,与间日疟原虫、恶性疟原虫、卵形疟原虫、三日疟原虫、诺氏疟原虫、冈地弓形虫、利什曼原虫、冈比亚锥虫均无交叉反应。以建立的fta-LAMP法检测20份PCR检测阳性的田鼠巴贝虫感染者血样,其阳性符合率100%。结论成功建立了检测田鼠巴贝虫特异性细胞色素B基因的fta-LAMP方法,该法特异性强、灵敏度高、简便、快速、适于现场应用。