摘要：旨在细胞水平上进一步探讨fut2基因的功能及其在猪小肠上皮细胞受到F18大肠杆菌(Escherichia coli,***)侵染时的调控机制,为提高仔猪对F18大肠杆菌病抵抗力的分子选育提供理论基础。运用Real-time PCR方法检测分析fut2基因在大肠杆菌F18ab、F18ac感染和脂多糖(LPS)诱导小肠上皮细胞前后的mRNA表达差异,并采用Western blotting方法检测大肠杆菌F18ab、F18ac感染小肠上皮细胞前后fut2的蛋白表达差异;同时设计并构建猪fut2基因慢病毒干扰载体,筛选并获得fut2基因稳定沉默的小肠上皮细胞系,检测fut2基因沉默对其所在球系列鞘糖脂生物合成通路其他关键基因(fut1、ST3GAL1、HEXA、HEXB、B3GALNT1、NAGA)表达以及小肠上皮细胞*** F18黏附能力的影响。结果表明,在F18大肠杆菌感染和LPS诱导小肠上皮细胞后,fut2基因的mRNA相对表达水平均极显著升高(P<0.01),同时大肠杆菌感染后小肠上皮细胞的fut2蛋白表达上升。此外,本研究成功构建fut2基因慢病毒干扰载体,并获得fut2基因稳定沉默的小肠上皮细胞系;fut2基因沉默后,其所在的球系列鞘糖脂生物合成通路其他关键基因的表达都存在不同程度的下降,其中fut1基因表达水平显著下调(P<0.05),ST3GAL1、HEXA和HEXB基因表达水平极显著下调(P<0.01),而B3GALNT1和NAGA基因表达水平未发生显著变化,同时fut2基因沉默后F18大肠杆菌对小肠上皮细胞的黏附能力显著降低。结果显示,fut2基因低表达可能不利于仔猪大肠杆菌受体的形成,以增强猪小肠上皮细胞抵抗*** F18感染的能力,本试验结果同时为球系列鞘糖脂生物合成通路在仔猪抗大肠杆菌感染过程中的作用机制研究提供一定的理论基础和依据。

摘要：为了揭示猪α-(1,2)岩藻糖转移酶2(fut2)基因密码子使用特性并提高其在外源宿主内的表达量,本研究综合运用EMBOSS Explorer网站和CodonW软件包分析了猪fut2基因的密码子使用偏好性的相关参数,并与3种模式生物(大肠杆菌、酵母菌和果蝇)基因组密码子使用模式进行比较,最后参照与之最为相近的模式生物基因组密码子使用方式,利用JCat和OPTIMIZER两个密码子优化网站对猪fut2基因密码子进行优化。结果显示,猪fut2基因表达水平不高,存在24种偏好密码子,且这24种偏好密码子中有23种以G/C结尾;猪fut2基因与果蝇基因组密码子使用模式的差异小于大肠杆菌和酵母基因组,表明果蝇更适合猪fut2基因的外源表达;根据果蝇基因组密码子使用模式优化猪fut2基因密码子,优化后其适应指数有了明显提高,而整体GC含量没有明显变化,说明在理论上猪fut2基因优化成功。本研究从翻译水平上揭示了猪fut2基因的密码子使用特性,为其在遗传改良中选择最佳外源表达系统及提高其在宿主细胞内的表达水平提供一定的理论依据。

摘要：猪α-(1,2)岩藻糖转移酶2(fut2)基因为鞘糖脂生物合成—球系列通路中的重要基因,可能在断奶仔猪抵抗大肠杆菌F18侵染过程中发挥着调控作用。为探究猪fut2基因的序列结构及其生物学功能,试验采用PCR扩增得到地方猪品种东串猪fut2基因的CDS全序列,进而预测和分析fut2基因的蛋白质序列及其功能区域,同时对其在8头35日龄东串断奶仔猪11个组织中的表达水平进行检测与分析。结果显示,fut2基因的CDS序列全长为1 023bp,共编码340个氨基酸,fut2蛋白为脂溶性的亲水蛋白,蛋白结构不稳定,该蛋白存在1个跨膜螺旋结构,但不存在信号肽,表明fut2蛋白为膜蛋白;fut2蛋白存在2个N-糖基化位点(185和305位氨基酸),无O-糖基化位点,此外该蛋白还存在14个潜在的磷酸化位点,包括6个Ser、2个Thr和6个Tyr,对其功能区域进行分析发现,fut2蛋白存在1个超级家族保守结构域:fut1-fut2-like(58-319位氨基酸);系统进化树结果显示,猪与牛的亲缘关系相对较近,与人、黑猩猩、大鼠和小鼠等亲缘关系相对较远;fut2基因在东串断奶仔猪11个组织中均有表达,在消化道和免疫组织中表达水平较高。试验结果推测fut2基因在断奶仔猪抵抗大肠杆菌F18中可能具有一定的作用,且可能是通过合成岩藻糖转移酶间接发挥其抵抗大肠杆菌F18的作用。

摘要：目前有研究表明fut2基因是仔猪大肠杆菌F18受体形成的关键候选基因,探讨fut2基因在仔猪出生至断奶期间的m RNA表达变化,可为进一步研究该基因对F18大肠杆菌致病的相关性提供一定的理论依据。本试验挑选4个日龄(8、18、30日龄和35日龄)苏太仔猪各4头,通过利用Real-time PCR方法分别比较分析了fut2基因在各个体11个组织(心、肝、脾、肺、肾、胃、肌肉、胸腺、淋巴结、十二指肠、空肠)中的表达规律。结果表明:fut2基因在不同日龄苏太猪11个组织中均有表达,其中在肺、肾、胃、胸腺、淋巴和十二指肠中呈现较高表达,在肝、脾、空肠中呈现中度表达,在心和肌肉中呈现低表达。fut2基因在8日龄个体空肠组织上的表达水平显著的高于其他3个日龄(P0.05)。由此推测,8日龄左右fut2基因的高表达可能有利于仔猪空肠组织中F18大肠杆菌受体的快速形成,需进一步对仔猪8日龄至18日龄间fut2基因的表达变化做进一步细致的检测。

摘要：本实验运用Real-time PCR方法检测分析α-(1,2)岩藻糖转移酶1(fut1)和α-(1,2)岩藻糖转移酶2(fut2)基因在大肠杆菌(***)F18ab、F18ac感染以及内毒素(LPS)诱导小肠上皮细胞(IPEC-J2)前后的mRNA表达差异,在细胞水平上进一步验证fut1、fut2基因的功能并探讨其在抗*** F18侵染过程中的作用机制。结果表明:fut1、fut2基因在***感染和LPS诱导细胞后的mRNA表达水平均极显著升高(P<0.01),且fut2基因的上升趋势要高于fut1基因。由此推测,fut1和fut2基因的表达水平与仔猪抵抗*** F18感染的能力密切相关,fut2基因可能发挥着比fut1基因更重要的调控作用。