摘要：以油茶‘湘林1号’品种的近成熟种子为材料,采用简并PCR、RACE等技术,获得了油茶fatb基因的全长cDNA克隆。RACE测序结果表明:油茶fatb基因不是一个单基因,而是一个多基因家族;用生物信息学的方法预测各RACE片段的起始密码子和终止密码子的位置,在起始密码子上游和终止密码子下游分别设计RT—PCR引物,RT—PCR扩增结合随机测序、生物信息学分析,分离克隆出5个基因家族成员,分别命名为co—fatb1、co—fatb2、co—fatb3、co—fatb4、co—fatb5,其全长CDS为1 272、1 311、1 305、1 305、1 263 bp,将上述基因序列提交至GenBank,登录号分别为FJ899670、FJ899671、FJ899672、FJ899673、FJ899674;最后,对油茶fatb的氨基酸序列的特殊位点进行了标识和分析。

摘要：为探究CRISPR/Cas9基因编辑技术在花生中的应用,利用花粉管注射浸花法和农杆菌介导法转化花生,通过在侵染液中添加合适浓度的AS、MES以及MgCl2·6H2O促进了转化事件的发生,并通过注射液每日现用现配最大程度地保持农杆菌的活力,提高了转化效率。本试验首次将该转化法用于基于CRISPR/Cas9技术的花生基因编辑,根据花生fatb基因序列设计编辑靶位点,成功构建CRISPR/Cas9基因编辑载体PX458-Cas9-fatb并成功转化农杆菌菌株GV3101;利用1 mL无菌注射器将当日离心配置的新鲜农杆菌侵染液注射到花生龙骨瓣中至花瓣浸透,每日8:00以前完成注射,连续注射15日,待注射花朵下针后用尼龙绳进行捆绑标记;待荚果成熟后,收获捆绑标记的花生荚果,正常晾晒干燥后剥取花生籽粒,提取籽粒基因组DNA,进行PCR扩增,筛选转化阳性籽粒。结果显示,在被检测的274粒籽粒中,有108粒扩增出了相应目的条带,转基因阳性率为39.42%;经测序验证,108粒阳性籽粒中有1粒在靶位点外发生了基因编辑,在部分阳性籽粒的自交后代中,发现了靶位点发生编辑的籽粒。因此,本研究初步证实利用注射浸花以及农杆菌介导法对基于CRISPR/Cas9技术的花生基因编辑是有效的,但编辑效率有待于进一步提高。