摘要：目的构建有效的针对人foxa1基因的shRNA干扰载体,并验证其干扰效果。方法设计合成3对针对人foxa1基因的和1对无同源性的shRNA片段,将合成的shRNA片段插入到干扰载体pRNAT-U6.1/Neo中,经过酶切和测序验证,成功构建人foxa1基因的shRNA和空白对照载体。将各干扰载体和空白载体转染人正常胃黏膜上皮细胞(GES-1)和胃癌细胞(SGC-7901),Realtime RT-PCR和Western-blotting检测干扰载体的干扰效率。结果①酶切和测序验证均表明各shRNA载体构建成功。将空载体及各干扰载体分别转染人正常胃黏膜细胞(GES-1)和胃癌细胞(SGC-7901)发现,和空白对照组相比,3组干扰载体能够从mRNA和蛋白表达水平明显抑制foxa1的表达,但是3组质粒的抑制效率有一定的差异,以3号质粒对foxa1的干扰效率最强。结论成功构建了三个有效的针对人foxa1基因的shRNA干扰载体,三组质粒都能有效地抑制foxa1在GES-1细胞和SGC-7901细胞中的表达。

摘要：目的构建叉头盒蛋白A1(Forkhead-box A1,foxa1)的pFLAG-CMV4-foxa1表达载体,为探究foxa1功能和作用机制奠定基础。方法设计引物,采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增foxa1的cDNA全长序列,产物电泳回收。随后将pFLAG-CMV载体进行酶切消化,与回收的foxa1的cDNA全长序列连接。将构建好的质粒转化到DH5a大肠埃希菌中,将验证正确的质粒进行提取纯化,然后将其转染至foxa1阴性细胞系HEK293T。HEK293T细胞转染pFLAG-CMV4-foxa1载体24 h后,收集其mRNA和总蛋白。通过实时荧光定量PCR检测mRNA的变化,同时采用免疫印迹法检测蛋白质表达情况。结果测序结果显示序列正确,载体构建成功;实时荧光定量PCR结果显示在HEK293T细胞中,foxa1基因的mRNA水平显著增加,免疫印迹结果显示foxa1蛋白正确表达。结论成功构建了人pFLAG-CMV4-foxa1,并可在HEK293T细胞内正确且高效表达,为后续foxa1功能和机制的研究提供了重要的工具。

摘要：目的构建叉头盒蛋白A1（Forkhead-box A1,Fox A1）的重组慢病毒表达载体,为探究其功能和作用机制奠定基础。方法设计基因引物,采用聚合酶链反应（PCR）扩增出Fox A1的c DNA序列,然后将其克隆至PCDH-CMV-MCS-EF1a-GFP-puro慢病毒表达载体上,经PCR、双酶切反应及DNA测序鉴定,将阳性重组Fox A1表达载体、p CMV-VSV-G和p CMV-d R8.91包装质粒共转染到HEK-293T细胞进行病毒包装收集病毒浓缩液,然后再感染293T细胞,通过观察绿色荧光蛋白来计算病毒滴度,最后用病毒转染原代培养人皮肤成纤维细胞（HFFs）,通过实时荧光定量PCR检测Fox A1 m RNA的表达水平。结果重组慢病毒表达载体Fox A1经PCR扩增、酶切及测序鉴定正确,并得到滴度为115;10~8 TU/m L的病毒液,病毒感染人皮肤成纤维细胞后表达显著增强。结论成功构建了人Fox A1重组慢病毒载体,并可在HFFs内高效表达,为后续Fox A1的功能和机理研究奠定了实验基础。