摘要：目的利用CRISPR/Cas9技术构建敲除g6pd基因常见突变位点——c.392g>T(p.131g>V)突变位点的HEK293T细胞,为后期研究其基因修复提供可靠的细胞模型。方法针对g6pd基因c.392g>T(p.131g>V)突变位点靶向设计4对向导RNA(sgRNA),构建表达Cas9-sgRNA的外源PX458质粒,将其转染至HEK293T细胞内,通过流式细胞术分选表达gFP荧光蛋白的细胞进行培养,利用T7核酸内切酶1(T7E1)酶切验证CRISPR/Cas9的剪切效率,有限稀释法筛选单克隆细胞,测序鉴定并检测g6pd mRNA、蛋白表达和细胞功能的改变。结果成功构建基于g6pd基因c.392g>T(p.131g>V)突变位点的Cas9-sgRNA外源PX458质粒,T7E1酶切检测四对sgRNA的编辑效率分别为6.74%、12.36%、12.54%、2.94%。测序鉴定敲除g6pd基因c.392g>T(p.131g>V)突变位点的细胞株构建成功,细胞g6pdmRNA、蛋白表达和g6pd酶活性降低,细胞增殖能力下降,维生素K3诱导细胞死亡增加。结论本研究成功构建敲除g6pd基因c.392g>T(p.131g>V)突变位点的HEK293T稳定细胞模型,为后期研究基因的修复奠定了基础。

摘要：根据小鼠肌肉的６－磷酸葡萄糖脱氢酶（Ｇ６ＰＤ）的ｃＤＮＡ序列设计并合成内外２对引物，以巢式ＲＴ－ＰＣＲ方法检测昆明小鼠１－、２－、４－、８－细胞期早期胚胎是否转录出Ｇ６ＰＤ的ｍＲＮＡ，结果发现１～８－细胞期早期胚胎的ｍＲＮＡ均能以外引物扩增产物为模板通过内引物扩增出一条３７８ｂｐ特异性条带表明昆明小鼠１～８－细胞期早期胚胎的Ｇ６ＰＤ基因已表达。

摘要：目的肾透明细胞癌(ccRCC)是一种代谢性疾病,葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(g6pd)与ccRCC的发生发展及患者的不良预后呈正相关。文章首次构建了g6pd缺陷型ccRCC稳定细胞株,检测其迁移表型。方法 Oligo Engine RNAi设计针对人g6pd基因3'端非编码区的siRNA及无关siRNA序列,合成双链后通过BglⅡ和HindⅢ酶切位点插入p SP-gFP/Neo表达载体,构建Caki-1-g6pd siRNA细胞株及Caki-1-Negative control细胞株,进而转染并经g418筛选。应用Real-time RT-PCR、Western blot及酶活性方法,检测细胞株的g6pd表达和酶活性;Transwell方法检测细胞迁移表型、Western blot检测p-STAT3/STAT3表达。结果荧光显微镜下可见Caki-1-g6pd siRNA细胞与Caki-1-Negative control细胞形态良好,通过gFP表达量计算细胞转染效率约为45%~55%;48 h后细胞贴壁密度达90%,荧光表达略有增强,转染效率可达60%。光镜和荧光显微镜下亦可见细胞状态良好,gFP阳性率达95%。与Caki-1-Negative control细胞相比,Caki-1-g6pd siRNA细胞的g6pd mRNA表达量蛋白表达量和酶活性均显著降低(P<0.05)。与Caki-1-Negative control细胞相比,Caki-1-g6pd siRNA迁移细胞的相对数量明显降低[(64.0±4.2)个vs(30.0±2.9)个,P<0.01],p-STAT3/STAT3值亦明显下降[(0.45±0.05)vs(0.24±0.01),P<0.01]。结论文章首次成功构建了g6pd稳定敲低和迁移能力低下的Caki-1细胞系,其g6pd敲低所致ccRCC细胞迁移能力降低与STAT3信号相关。

摘要：针对应用型生物技术(医药方向)人才培养,立足于学校办学条件,我们设计并实施了生物化学综合性实验项目《原核表达的重组人g6pd的分离纯化及酶活测定》。本文从教学对象、教学目标、教学内容的选择与安排三方面阐述该项目的设计;从课前的启发引导、课中的实验细节、课后的分析结果以及课程思政四方面阐述教学的实施;最后通过问卷评价教学效果。该实验涉及多个理论知识和实验技能整合,具有一定探究性,能激发学生对生物化学学习的兴趣,适合用于本科生实践能力、创新能力和科研兴趣培养。