摘要：目的利用pGCsi—U6-GFP质粒构建干扰人转录因子gli1基因的小发夹RNA（shRNA）表达载体，并进行干扰活性鉴定。方法根据GenBank中gli1cDNA的序列，设计并合成3条gli1siRNA，分别克隆至质粒载体pGCsi-U6-GFP中构建重组质粒，转化大肠杆菌DH5a，扩增后提取质粒，行PCR及测序鉴定。脂质体转染法将鉴定正确的3个重组质粒pGCsi—U6-gli1siRNA-1、pGCsi—U6-GHlsiRNA4、pGCsi—U6-gli1siRNA-3及作为阴性对照质粒的pGCsi—U6-gli1siRNA—C分别与过表达质粒pEGFP—N1-gli1共转染HEK293细胞株，48h后收集细胞，半定量RT—PCR及蛋白质印迹法检测各组细胞gli1mRNA及蛋白的表达，鉴定筛选出最佳干扰质粒。结果3个重组质粒pGCsi-U6-gli1siRNA-1、pGCsi—U6-gli1siRNA-2、pGCsi-U6-gli1siRNA-3均扩增出预期大小（369bp）的片段，经测序证实与设计合成的序列完全一致。3个重组质粒转染HEK29细胞后细胞gli1mRNA表达量分别为0．290±0．011、0．421±0．018、0．373±0．018，蛋白表达量分别为0．318±0．026、0．433±0．021、0．381±0．018，均显著低于阴性对照质粒转染细胞的0．834±0．022及0．818±0．024（P=0．000）。gli1mRNA表达抑制率分别达65．8％、50．7％、55．7％，蛋白表达抑制率分别为63．9％、48．3％、53．9％，以pGCsi-U6-gli1siRNA．1的干扰作用最强。结论成功构建了靶向gli1的shRNA表达载体，筛选出具有最佳干扰效果的质粒，为进一步研究gli1基因功能奠定了基础。