摘要：为建立一种灵敏性高、特异性强、可自动化检测犬猫弓形虫的分子学诊断方法,本研究提取弓形虫RH虫株DNA,以致密颗粒蛋白7(gra7)基因保守区为靶标,设计特异性引物并构建标准质粒pMD18-gra7,以标准质粒pMD18-gra7作为模板,建立SYBR-GreenⅠ荧光定量PCR(real-time PCRor qPCR)检测方法。结果显示,该方法特异性引物只能扩增出弓形虫DNA样品,对阴性样品及其他犬猫寄生虫阳性样品DNA则未见扩增曲线。所建qPCR方法的检测下限为3 copies,当标准品浓度为3 copies/μL时,检测Ct值为29.4。对犬猫临床样品进行检测,并与商品化试剂盒结果相比校,阴阳性符合率达100%。上述结果表明,本研究建立的SYBR-GreenⅠ荧光定量PCR方法特异性好,敏感性强,结果稳定,可用于犬猫弓形虫病的临床检测。

摘要：目的:构建弓形虫致密颗粒抗原gra7的真核重组表达质粒。方法:设计gra7的特异引物,采用多聚酶链反应(PCR)技术从弓形虫RH株基因组DNA中扩增编码gra7的基因片段,经克隆至pMD18-T载体后,亚克隆至真核表达载体pVAX1而构建真核重组表达质粒pVAX1-gra7。结果:PCR扩增出gra7基因的特异片段,所获克隆的序列正确,并被亚克隆到真核表达载体pVAX1,构建了真核重组表达质粒pVAX1-gra8。结论:成功构建了gra7的真核重组表达质粒pVAX1-gra7。