摘要：目的:构建人谷胱甘肽-S-转移酶Z1(glutathione S-transferase zeta 1,gstz1)重组腺病毒,并初步研究gstz1调控粘附连接信号通路(adhesion junction pathway)靶基因SMAD3、IGF1R等影响肝癌细胞的迁移能力。方法:PCR扩增gstz1 cDNA序列并克隆到腺病毒载体pAd Track-TO4,构建重组腺病毒质粒p Ad Track-gstz1,将重组质粒用Lipofectamine 2000转染至HEK293细胞中,包装、扩增成高滴度重组腺病毒Adgstz1。首先,将SMMC-7721细胞设为3组:Mock组、AdGFP组和Adgstz1组,Mock组为空白对照组,AdGFP组为感染腺病毒AdGFP的对照组,Adgstz1组为感染腺病毒Adgstz1的实验组。然后,通过Transwell实验和MTS实验观察其对肝癌细胞迁移增殖能力的影响,进一步经qRT-PCR及Western blot技术研究gstz1通过调控粘附连接信号通路关键分子影响肝癌细胞的迁移。结果:成功构建了高滴度重组腺病毒Adgstz1,经Western blot鉴定gstz1在SMMC-7721细胞中的表达。Transwell实验结果表明,Adgstz1组与Mock组及AdGFP组相比,能够明显抑制人肝癌细胞的迁移能力;与Mock组相比,抑制率为(68.10&#177;1.63)%(P=0.000),与AdGFP组相比,抑制率为(50.70&#177;0.99)%(P=0.000)。MTS实验结果表明,Adgstz1组在72 h和96 h的吸光度值分别为(1.13&#177;0.08)和(1.28&#177;0.07),AdGFP组72 h和96 h的吸光度值分别为(1.28&#177;0.03)和(1.45&#177;0.03),Adgstz1组在96 h的吸光度值与对照组相比明显降低,差异有统计学意义(P<0.01)。另外q RT-PCR及Western blot结果显示,与Mock组和AdGFP组相比,Adgstz1感染细胞内粘附连接信号通路中靶基因SMAD3、IGF1R等的表达明显降低。q RT-PCR结果显示,Adgstz1组与AdGFP组相比,TGFBR1相对表达量为(0.58&#177;0.13)(t=4.609,P=0.010),SMAD3相对表达量为(0.51&#177;0.08)(t=8.030,P=0.000),ERBB2相对表达量为(0.46&#177;0.09)(t=9.384,P=0.000),IGF1R相对表达量为(0.45&#177;0.02)(t=14.480,P=0.000),FARP2相对表达量为(0.37&#177;0.13)(t=7.082,P=0.028)。Western blot表明,SMAD3组中,AdGFP组的蛋白相对表达量为(0.96&#177;0.18),Adgstz1实验组的蛋白相对表达量(0.39&#177;0.01)(P=0.001)。IGF1R组中,AdGFP组的蛋白相对表达量为(0.97&#177;0.05),Adgstz1实验组的蛋白相对表达量(0.44&#177;0.02)(P=0.000)。结论:gstz1通过调控粘附连接信号通路相关靶基因的表达抑制肝癌细胞的迁移。

摘要：目的:通过CRISPR/Cas9系统在HepG2肝癌细胞系中构建人谷胱甘肽S-转移酶ζ1(glutathione S-transferase zeta,gstz1基因敲除模型并探索gstz1敲除对肝癌细胞增殖和迁移能力的影响。方法:设计并合成长度20 bp的靶向gstz1的sgRNA寡核苷酸序列,退火后克隆到LentiCRISPR-V2载体上,与慢病毒包装质粒共转染HEK293T细胞,包装慢病毒并感染HepG2细胞,用合适浓度的嘌呤霉素筛选阳性细胞株,有限稀释法获得单克隆细胞。所有实验均分成3组:parental组、KO1组和KO2组,采用MTS实验、克隆形成实验和划痕实验分别检测细胞增殖和迁移能力。结果:Western blot和DNA测序鉴定gstz1敲除的单克隆细胞构建成功;MTS检测不同时间点下各组HepG2细胞的增殖能力变化情况。结果显示,48 h时,KO1组[(24.758&#177;1.508)%]相比亲本组[(20.185&#177;0.720)%],增殖能力明显增强,差异有统计学意义(P=0.002)。72 h时,相比亲本组[(23.903&#177;0.840)%],KO1组[(28.634&#177;1.848)%]增殖能力明显增强(P=0.014)。96 h和120 h时,KO1组相比亲本对照组,其增殖能力也明显增强(P<0.05)。在KO2细胞中观察到同样现象,说明敲除gstz1后能够促进Hep G2细胞的增殖能力。克隆形成实验表明,gstz1敲除细胞株(KO1和KO2)克隆形成数(73.330&#177;1.528、82.330&#177;4.163)相比亲本细胞克隆形成数(42.330&#177;2.517)增多,差异有统计学意义(P=0.000,P=0.000),提示gstz1基因敲除可以明显促进肝癌细胞的增殖能力。划痕实验结果显示,gstz1敲除细胞株KO1和KO2在48 h的迁移相对比分别为0.327&#177;0.041、0.371&#177;0.013,与亲本细胞(0.184&#177;0.045)相比明显增加(P=0.003,P=0.001),提示gstz1基因敲除可明显促进肝癌细胞的迁移能力。结论:gstz1缺失明显促进肝癌细胞的增殖和迁移能力,提示gstz1可能作为抑癌基因调控肝癌的发生和进程。