摘要：G蛋白偶联受体(GPCR)是生物体内一类庞大而又多样的细胞膜蛋白。GPCR可以应细胞外信号发生构象变化,进而结合不同效应蛋白激活下游多种信号转导通路,调控众多生命活动过程,参与几乎所有病理过程的发生和发展。近年来,冷冻电镜技术在研究生物大分子结构方面取得了突飞猛进的发展,基于冷冻电镜的GPCR信号转导复合物的高分辨率三维结构不断出现。本文阐述了GPCR和G蛋白复合物相互作用的共性结构特征——受体第六个跨膜螺旋的构象变化,也展示了GPCR识别不同G蛋白亚型选择性的结构基础。单颗粒冷冻电镜提供了更加高效地鉴定受体与配体相互作用分子机制的方法,为GPCR信号通路的机制研究以及基于结构的药物理性设计提供了重要信息。

摘要：目的研究Rab1对大鼠肺微血管内皮细胞(RPMVECs)β肾上腺素受体(β-ARs)表达的调节作用。方法取原代培养的RPMVECs作为研究对象,设计3个实验:(1)检测海水干预对β-ARs表达的影响,设对照组和海水处理(SW)组。(2)构建大鼠野生型Rab1慢病毒表达载体(Rab1WT)和Rab1阴性突变体慢病毒表达载体(Rab1N124I),检测两种质粒转染对β-ARs及其亚型(β1-AR、β2-AR)表达的影响,设对照组、转染Rab1WT组(WT组)和转染Rab1N124I组(N124I组)。(3)检测Rab1WT转染对海水处理β-ARs表达的影响,设对照组、SW组和转染Rab1WT后海水处理组(WT/SW组)。上述3个实验中,对照组RPMVECs常规培养至实验结束;SW组细胞常规培养后用海水处理2h;WT组和N124I组细胞分别转染Rab1WT和Rab1N124I(滴度109TU/ml);WT/SW组细胞转染Rab1WT后培养48h,用海水处理2h。β-ARs及其亚型的表达均采用配体饱和测定法进行检测。结果 (1)对照组和SW组RPMVECs表面β-ARs的表达量分别为2107.00±202.36和1324.00±130.01cpm/105细胞,差异有统计学意义(P0.05),与SW组比较增加了58%(P<0.01)。结论海水干预可降低β-ARs在RPMVECs细胞膜上的表达,Rab1可对抗该作用,使β-ARs的表达上调。

摘要：目的探讨基于μ阿片受体(MOR)羧基端^(375)STANT^(379)磷酸化位点的多肽TAT-Q368-T379干预,对μ阿片受体下游信号通路的影响。方法将HA-MOR质粒与pGloSensorTM-22F质粒共转染的HEK-293细胞分为空白组(A组)、DAMGO组(B组)、吗啡组(C组)、0.5×10^(-5)mol/L多肽TAT-Q368-T379与吗啡联用组(D组)、10-5mol/L多肽TAT-Q368-T379与吗啡联用组(E组)、2×10^(-5)mol/L多肽TAT-Q368-T379与吗啡联用组(F组),通过GloSensor cAMP生物传感器测定各组细胞中的cAMP含量。将MOR-C端标记Nanoluc的质粒以及β-arrestin2-N端标记EYFP的质粒共转染完成的HEK-293细胞分为空白组(G组)、DAMGO组(H组)、吗啡组(I组)、10^(-5)mol/L多肽TAT-Q368-T379与吗啡联用组(J组)、3×10^(-5)mol/L Cmpd101与吗啡联用组(K组),通过蛋白质相互作用分析法测定各组细胞MOR激动后对β-arrestin2的募集效应。将HA-MOR质粒转染完成的HEK-293细胞分为空白组(L组)、吗啡组(M组)、10^(-5)mol/L多肽TAT-Q368-T379与吗啡联用组(N组)以及3×10^(-5)mol/L Cmpd101与吗啡联用组(O组),通过细胞免疫荧光染色法检测各组细胞的受体平均荧光强度。结果GloSensor cAMP生物传感器检测结果显示,C~F组细胞EC_(50)值差异有显著性(F=13.12,P<0.05),其中D、E、F组EC_(50)值较C组均显著减小(P<0.05)。蛋白质相互作用分析法分析显示,I~K组细胞E_(max)值差异有显著性(F=185.95,P<0.05),其中J、K组E_(max)值较I组均显著减小(P<0.01)。细胞免疫荧光染色法染色结果显示,L~O组细胞表面受体荧光强度比较差异有显著性(F=17.46,P<0.05),其中与M组比较,N、O组细胞表面受体荧光强度均显著增高(P<0.01)。结论基于MOR羧基端^(375)STANT^(379)磷酸化位点设计的多肽TAT-Q368-T379可有效增强吗啡介导的MOR下游G蛋白信号通路的激活,减少吗啡介导的β-arrestin2招募,从而减少由吗啡介导的MOR的内吞。