摘要：根据已发表的牛流产型布鲁氏菌HtrA(High temperature requirment A)基因、groel(热休克蛋白)基因设计特异性引物,从新疆绵羊种布鲁氏菌基因组中扩增出HtrA、groel基因片段,将HtrA、groel基因片段纯化后分别克隆到T载体上测序,结果表明新疆绵羊种布鲁氏菌HtrA基因片段长1542 bp,编码513个氨基酸,与发表的牛种(***)、羊种(***)、猪种(***)的HtrA基因序列的同源性分别为99.68%、99.81%、99.55%。groel基因片段长1641 bp,编码546个氨基酸,与***、***以及*** groel基因的核苷酸序列同源性分别为99.88%、99.82%、99.88%。HtrA基因和groel基因与发表的***、***、***的HtrA基因和groel基因序列的具有很高的同源性。按正确的阅读框架分别将两基因片段定向克隆到表达载体pET-28a上,将重组质粒转化到大肠杆菌BL21菌株,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳和western blot分析表明,HtrA、groel基因能在大肠杆菌中成功表达,表达的蛋白分子量都约为60 Ku,并能和布鲁氏菌免疫兔子产生的抗体发生特异性的结合。

摘要：以玉米蚜杨凌生物型为材料,设计特异性引物采用PCR的方法在国内首先克隆了一种玉米蚜体内参与传毒的共生菌groel基因,序列测定结果表明:玉米蚜杨凌生物型共生菌groel基因全长为1647bp.编码548个氨基酸,登录Genebank,序列号为AF387863。构建了该基因的原核表达载体,用pBV221表达出63KDa的非融合目的蛋白,用pET-30a表达出69KDa的融合蛋白,二者均有较高的表达量。

摘要：根据已发表的牛型布氏杆菌(Brucella abrotus)基因序列设计一对特异性引物,以***19株基因组为模板,通过PCR扩增groel基因,经T-A克隆后进行序列测定和分析。结果表明,groel基因全长1 641bp,编码546个氨基酸。将groel定向克隆至表达载体pET32a中,构建重组表达质粒pET32a-Lgroel,然后转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下成功获得重组表达蛋白His-groel,大小为81 kDa。经Western blot检测,牛布氏杆菌阳性血清中有groel抗体存在,表明该蛋白具有免疫原性。对重组表达蛋白His-groel进行酶促活性检测,结果表明该蛋白在体外具有催化ATP水解的酶活性和促进乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)复性的功能。

摘要：【目的】以遗传片段分析仪内标法替代传统放射性标记引物延伸技术进行样本转录起始位点(TSS)分析,并弥补引物延伸技术应用于未知样本缺乏前期预测和后期评估环节,形成一套基于遗传片段分析仪内标法分析未知样品TSS的完整技术方案。【方法】以粘球菌Myxococcus DK1622来源的双拷贝Gro ELs基因为素材;首先从预测出发,利用数据库进行启动子和转录起始位点预测;其次,根据预测结果设计合成荧光标记引物进行靶标m RNA的反转录;再次,应用遗传片段分析技术内标法鉴定分析粘球菌来源的双拷贝Gro ELs基因转录起始位点(TSS)及其丰度;最后,应用正态分布理论进行鉴定结果评估。【结果】明确了转录起始位点的数量、转录丰度及最可能的TSS位点:粘球菌DK1622基因组中Gro EL1拷贝存在1个启动子,TSS位点为TSS_(286);Gro EL2拷贝存在2个启动子,TSS位点分别为TSS_(548)和TSS_(502),其中TSS_(548)转录丰度是TSS_(502)的13.8倍,Gro EL1的TSS_(286)丰度是gro EL2的TSS_(548)丰度的14.3倍。【结论】预测结果指明了实验设计的范围,遗传片段分析仪内标检测法替代传统放射性标记法使实验更加简便、安全、自动、准确,正态分布理论进一步评估了实验结果的可信度,三者接合形成了完善的转录起始位点鉴定技术方案。