摘要：利用CRISPR/Cas9和ES细胞技术,在小鼠ES细胞株上敲除小鼠h2-k1基因,为研发MhCⅠ类基因人源化小鼠打下基础。设计了两个单向导RNA(single guide RNA,sgRNA),分别靶向h2-k1基因的外显子2和外显子3。以p X330质粒为骨架构建表达sgRNA的打靶载体。用电穿孔转染法将构建好的质粒以及p SUPER-puro共同导入小鼠ES细胞中,实现基因敲除。在嘌呤霉素筛选后,利用PCR初步检测靶基因的敲除情况,再通过测序以及流式细胞分析确定敲除h2-k1基因的小鼠ES细胞。结果显示:利用CRISPR/Cas9技术,小鼠ES细胞的h2-k1基因被成功敲除,通过PCR检测到4个克隆为h2-k1单等位基因敲除(19.0%),2个克隆为h2-k1双等位基因敲除(9.5%)。经过测序以及流式细胞分析,2株小鼠ES细胞被确认为h2-k1双等位基因敲除。本研究利用CRISPR/Cas9技术得到h2-k1基因敲除的小鼠ES细胞株,为MhCⅠ类基因的敲除和置换提供了参考。