摘要：h3亚型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)感染宿主广泛,具备跨物种传播的能力,不但造成了家禽的发病,还导致了多起人感染病例,具有重要的公共卫生意义。因此,有必要建立一种快速灵敏的h3亚型AIV的检测方法。本研究参考了GenBank近年来公开的h3亚型AIV hA基因序列,在保守区域设计一对特异性引物和Taq Man探针。通过对反应条件的优化,分别以cRNA阳性标准品和病毒核酸标准品为模板绘制标准曲线,建立了针对h3亚型AIV的荧光定量RT-PCR检测方法,并对其特异性、灵敏性、重复性进行评估。进一步使用实验室攻毒鸡组织样品和临床拭子样品对该方法进行了验证。结果表明,该方法特异性强,与其他亚型AIV和常见禽类病原体均无交叉反应;检测下限分别为1.0×10^(2) copies·μL^(-1)和10^(2) EID 50·0.1 mL^(-1),灵敏度与常规RT-PCR相比提高了10倍;组内和组间变异系数均小于1.5%,重复性较好。动物攻毒临床试验样品和临床拭子样品检测结果显示,该检测方法敏感性高于普通RT-PCR方法,与病毒分离鉴定结果一致,符合率为100%,可用于临床检测。综上,本研究建立的h3亚型AIV荧光定量RT-PCR检测方法具备特异、快速、灵敏等特点,为h3亚型AIV的快速诊断和监测及防控提供一定的技术支持。

摘要：旨在建立h3亚型犬流感病毒(canine influenza virus, CIV)荧光定量PCR方法,利用该方法对病毒在犬肾细胞(MDCK细胞)上增殖特性进行研究。根据CIV的血凝素(hA)片段上的hA2基因保守区设计并合成特异性引物,构建CIV-hA重组质粒作为标准品,经过条件优化,建立h3亚型CIV荧光定量检测方法,对其敏感性、特异性和重复性进行评价,并将该方法应用于CIV在MDCK细胞上增殖特性的研究,与病毒滴度(TCID;)进行相关性分析。结果显示:该方法具有较好的敏感性、特异性和重复性,最低检测线可以达到20.8 copies/μL,与犬瘟热病毒、犬细小病毒、犬副流感病毒、犬腺病毒2型、h1亚型流感病毒不发生交叉反应,批间、批内重复性良好(变异系数<1.1%)。将该方法应用于检测CIV在MDCK细胞上的增殖特性,与细胞培养法测定病毒滴度相比,二者具有较好的相关性。本研究初步建立了h3亚型CIV荧光定量检测方法,该方法可为CIV的增殖特性研究提供工具。

摘要：为建立一种快捷、可行的检测h3亚型猪流感病毒(SIV)的方法,本研究根据GenBank中登录的h3亚型SIV hA基因的保守序列,设计合成一对特异性引物,建立了一种检测h3亚型SIV的SYBR GreenⅠ荧光定量检测方法,并进行灵敏度、稳定性和特异性试验,与普通PCR进行比较。研究结果表明,标准曲线的循环阈值与模板浓度呈现良好的线性关系,R2为0.994,CV在0.17%～1.41%之间,具有良好稳定性。除h3亚型SIV外,对h1、h4、h6、h9亚型SIV以及猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、口蹄疫病毒和猪圆环病毒2型的检测均为阴性,与普通PCR相比更灵敏。该方法特异性好,准确率高,适于临床分离鉴别h3亚型SIV。

摘要：通过RT-PCR方法克隆了h3亚型猪流感病毒hA基因一段靶序列，构建重组质粒作为标准阳性模板。根据GenBank中的h3亚型猪流感病毒hA基因保守序列设计了用于FQ-PCR的1对引物和1条TaqMan探针。通过条件优化，以10倍系列稀释的质粒为标准品进行荧光定量PCR扩增，并制作标准曲线，建立了检测h3亚型猪流感的荧光定量PCR方法。结果表明，该方法检测灵敏度可达1．0×10^0拷贝／μL，线性范围为10^9-10^0，达10个数量级；对起始浓度为1．0×10^9、1．0×10^8、1．0×10^7拷贝／μL的标准品的最终实际测得值（Ct）分别为13．68，18．21和20．57；变异系数分别为0．31％、0．17％和0．12％，均小于5％，说明此方法具有良好的准确性和重现性。对阳性组织病料的检测表明，该方法的检测灵敏度高出常规PCR，与套式PCR具有相近的灵敏度。

摘要：为建立简便、快速同时检测h1和h3亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)的方法,根据GenBank中h1亚型AIV-hA基因和h3亚型AIV-hA基因的序列,分别设计了2对针对h1AIV和h3AIV的保守基因序列的引物。应用这2对引物对混有h1AIV和h3AIV的模板进行二重PCR扩增,得到了2个特异性扩增条带,大小与试验设计相符的302bp(h1AIV)和626bp(h3AIV),而对其他亚型AIV和禽呼吸道病原体的PCR扩增结果均为阴性,敏感性测定结果表明,该二重PCR技术能同时检出50pg的h1AIV模板和26pg的h3AIV模板。

摘要：【目的】建立用于检测禽流感病毒(Avianinfluenzavirus,AIV)且能同时区分h1和h3亚型AIV的方法,为有效防控禽流感(Avianinfluenza,AI)奠定基础。【方法】根据h1亚型、h3亚型AIV-hA基因和M基因的保守核苷酸序列,分别设计3对特异性引物,以含有h1亚型AIV和h3亚型AIV的cDNA为模板,对三重PCR扩增条件进行优化,验证其特异性和敏感性,并对临床样品进行AIV检测。【结果】h1和h3亚型AIV混合模板经三重PCR扩增可获得3条特异性条带,其中302bp为h1亚型hA基因、453bp为M基因、626bp为h3亚型hA基因;含有h1或h3亚型AIV的模板均出现两条特异性条带,大小分别为302和453bp、453和626bp;含有其他亚型AIV的模板仅出现一条特异性条带(453bp);而其他禽呼吸道疾病病毒均未扩增出任何条带。优化后的三重PCR最低能同时检测出7.00pg的h1亚型AIV、3.62pg的M基因和20.60pg的h3亚型AIV;对100个临床样品进行AIV检测,AIV总阳性率为36%,其中h1亚型阳性率4%、h3亚型阳性率9%、其他亚型阳性率23%。【结论】禽流感病毒h1、h3亚型和M基因三重PCR检测方法具有快速、敏感、特异等特点,适用于AIV的检测及h1和h3亚型AIV的分型检测。

摘要：目的根据禽流感病毒h1、h3、h5亚型的hA基因和N2型NA基因的保守序列,设计出四对RT-PCR引物,建立一步法多重RT-PCR对禽流感h1、h3、h5、N2四亚型进行快速检测。方法利用所设计的四对引物,通过对该方法扩增条件的优化,成功建立快速检测禽流感病毒h1、h3、h5、N2四亚型的一步法多重RT-PCR。利用禽流感h1、h3、h5、N2四亚型毒株和其它相关标准毒株进行敏感性和特异性试验。结果与结论所建立的一步法多重RT-PCR具有较高的特异性和敏感性,与禽流感其它亚型和NDV、IBV、ARV?IBDV的核酸均无交叉反应。用该方法检测现场样品395份(4省20多个地区),结果与经典检测方法一致。

摘要：目的利用荧光定量RT-PCR技术建立一种快速检测流感病毒h1、h3亚型的方法。方法根据h1、h3亚型流感病毒hA基因的相对保守序列,设计两对引物及其相应的Taqman探针,利用一步法RT-PCR试剂盒建立优化反应体系后,将荧光定量RT-PCR的产物采用10倍稀释法,即107～100copies/μl,再次用荧光定量PCR方法检验建立体系的灵敏度和重复性,并建立相对定量标准曲线;利用多种流感病毒和具有相似临床症状的呼吸道病毒检验建立体系的特异性。结果 h1和h3亚型流感病毒的检测灵敏度为102copies/μl,扩增效率分别为101.35%和113.28%,标准曲线相关系数大于99%,重复性良好,特异度实验未发现有非特异性扩增。结论本研究建立的双重荧光定量RT-PCR技术可以快速、准确地检测h1、h3亚型流感病毒。

摘要：根据h1和h3亚型猪流感病毒（SIV）血凝素（hA）编码基因的保守序列,分别设计合成特异性引物和Taq Man-MGB探针,建立了一种检测h1和h3亚型SIV的二重荧光RT-PCR方法。结果显示,该方法仅对h1和h3亚型SIV呈特异性扩增,对h9亚型SIV、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪瘟病毒（SFV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）和猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）无交叉扩增反应;用该方法检测h1和h3亚型SIV的hA基因的RNA标准对照（SIV-h1-RNA,SIV-h3-RNA）,最适线性检测范围分别为3.7×10~1~3.7×10~8拷贝数/反应和3.4×10~0~3.4×10~8拷贝数/反应,最低检出限分别为38和34个拷贝数;该方法的组内试验和组间试验的变异系数均小于2.0%,显示其具有良好的可重复性。用该方法对520份进口猪的鼻拭子样本和78份国内猪鼻拭子样本进行SIV检测发现,进口猪鼻拭子样本的SIV检测结果均为阴性,12份国内猪鼻拭子样本的h1亚型SIV检测结果为阳性,5份国内猪鼻拭子样本的h3亚型SIV检测结果为阳性。本方法的建立为h1和h3亚型SIV检测提供了一种快速、敏感和特异的技术手段。

摘要：根据GenBank中h1N1和h3N2亚型猪流感病毒(SIV)血凝素(hemagglutinin,hA)、神经氨酸酶(neuraminidase,NA)和M基因保守序列,分别设计合成了5对特异性引物,利用RT-PCR技术对SIV的型和亚型进行鉴定。结果表明,该方法的型RT-PCR可以检测出104 EID50病毒量所提取的RNA;h1、h3、N1和N2的亚型RT-PCR均可以检测出104 EID50病毒量所提取的RNA。除每对特异性引物所对应的亚型外,对其他亚型及猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪瘟病毒(CS-FV)的检测均为阴性,应用该方法对临床样品进行检测,其结果与病毒分离结果符合率为100%。结果表明,该方法特异性好、敏感性高,有望成为SIV的一种特异、敏感、快速的分型检测方法,为猪流感分子流行病学的调查奠定了良好的基础。