摘要：h7亚型禽流感病毒致病性强、危害性大,是进出口家禽及禽类产品的主要检疫对象。为了加强对h7亚型禽流感病毒的检测,建立新的快速检测方法。通过对GenBank已报道的h7亚型禽流感病毒的hA基因进行序列分析比较,设计了两套分别针对h7N2亚型和h7Nx亚型的特异性引物和用FAM标记的Taq Man MGB核酸探针,建立了h7亚型禽流感病毒实时荧光定量RT-PCR方法(Real-time RT-PCR)。该方法特异性好,不存在假阴性和假阳性的现象;敏感性高,对禽流感病毒h7亚型标准hI抗原检测的敏感性达到10-5,能够满足口岸禽流感病毒快速、准确、有效的检疫需求。

摘要：为了建立灵敏、特异的h7亚型禽流感病毒(AIV)微滴式数字PCR(ddPCR)检测方法,本研究根据GenBank和GISAID中h7亚型AIV血凝素(hA)基因的核苷酸序列,设计合成h7亚型AIV的引物和探针,对反应条件进行优化,从而建立检测h7亚型AIV的ddPCR方法,并测定其特异性、敏感性和重复性。结果显示,最佳引物浓度和探针浓度分别为900 nmol/L和250 nmol/L,最佳退火温度为55℃,最佳升降温速率为2.0℃/s,最佳反转录时间为20 min。特异性试验结果显示,该方法仅对h7亚型AIV进行特异性检测,对h5亚型AIV、h9亚型AIV、新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒、传染性法氏囊病毒均不能检出。敏感性试验结果显示,该方法对重组质粒标准品检测下限为0.8 copies/μL,比荧光定量PCR(qPCR)方法敏感性高10倍。组内和组间重复性试验结果显示,变异系数均小于3%。对60份临床样品检测显示,该方法与鸡胚分离方法的符合率为100%。结果表明,本研究建立的h7亚型AIV ddPCR检测方法具有较好的特异性、重复性和敏感性,可用于h7亚型AIV的早期诊断、流行病学调查、诊断方法评估、标准物质研制、免疫效果评估,为h7亚型AIV的科学防控和研究提供了有力的技术储备。

摘要：从禽流感病毒A/Chicken/1/2002(h7N1)核酸中扩增了完整hA的基因编码序列,克隆测序后,采用体外转录方法制备c RNA。用RNA保存液稀释至含量约108Copies/μL。分装后进行均匀性和稳定性检验,通过8家实验室联合定值,取平均值作为定值结果;经统计分析计算了该标准品的不确定度。此外,采用Taq Man方法,根据禽流感病毒h7亚型的血凝素基因的末端,采用1对引物和2条MGB探针,建立了禽流感病毒h7亚型Taq Man荧光RT-PCR快速检测技术。应用建立的方法对研制的标准品进行检测,检测限可达10基因拷贝;对新城疫病毒及其他亚型的流感病毒核酸进行检测,结果表明,建立的方法特异性良好,而且双探针的设计思路更能保证病毒核酸的有效检测,防止漏检。

摘要：参考禽流感病毒(AIV)M基因和hA基因序列设计了3对引物,其中1对为针对不同hA亚型AIV的通用引物,另外2对为分别针对AIVh5和h7亚型的特异性引物。这些引物所扩增的cDNA片段大小分别为244、860和634bp。利用这3对引物,通过对多重RTPCR扩增条件的优化,成功建立了快速检测鉴别AIVh5、h7亚型的多重RTPCR技术。特异性和敏感性试验结果表明,该技术对AIVh5亚型同时扩增出2条大小分别为244bp和860bp的cDNA片段;对AIVh7亚型同时扩增出2条大小分别为244bp和634bp的cDNA片段;对AIVh5和h7亚型混合样品能同时扩增出3条大小分别为244、860和634bp的cDNA片段;对其他AIVhA亚型只扩增出1条244bp的cDNA片段;对其他常见禽病病原扩增均为阴性;该多重RTPCR对AIVRNA、AIVh5和AIVh7亚型RNA的最低检出量分别为10、100和100pg。

摘要：目的参考AIVM基因和hA基因序列,设计了两对引物。其中XZ145-2和XZ146为通用引物,可以检测所有亚型AIV,跨幅244bp;XZh7-1和XZh7-2为h7亚型特异性引物,跨幅634bp。利用这两对引物,通过对多重RT-PCR扩增条件的优化,成功建立了快速检测鉴别h7亚型AIV的多重RT-PCR技术。特异性和敏感性试验结果表明,该技术对h7亚型AIV同时扩增出两条大小分别为244bp和634bp的cDNA片段,对其他亚型AIV只扩增出244bp的cDNA片段,对其他常见禽病病原无特异性扩增,结果为阴性;该多重RT-PCR对AIVRNA的最低检出量为1pg,对h7亚型AIVRNA的最低检出量为10pg。

摘要：参考已发表的禽流感病毒 (AIV)h7亚型血凝素 (hA)基因序列设计引物 ,经RT PCR扩增了AIV h7亚型的hA1基因片段 ,再将该片段定向插入到原核表达载体 pGEX 4T 2中 ,转化大肠埃希氏菌。重组表达载体经酶切和测序鉴定后 ,用IPTG诱导表达。用Western blotting和ELISA试验鉴定表达产物的抗原性。结果表明 ,融合表达蛋白能与AIVh7N1、h7N2、h7N7和h1N1亚型标准抗血清反应 ,而与h5N1、h9N 2等其他 13个亚型的抗血清无交叉反应。

摘要：目的旨在建立同时鉴别诊断h7亚型及其5种NA亚型(N2、N3、N4、N7和N9)AIV的检测方法。方法针对h7亚型hA基因、5种NA亚型NA基因和所有亚型AIV M基因的保守序列,分别设计了6对亚型特异性引物和1对AIV亚型通用检测引物,利用GeXP多基因表达和毛细管电泳分析技术,建立同时检测h7亚型和5种NA亚型AIV的GeXP高通量分型鉴别诊断方法,对其进行特异性、敏感性和临床样品检测。结果特异性结果显示该法单管可同时检测h7、N2、N3、N4、N7和N9亚型AIV,均能检出对应的亚型AIV,通用检测引物检出所有亚型AIV,与其它常见禽病病原体不存在交叉反应。敏感性结果显示该法对7种AIV目的基因(含h7、N2、N3、N4、N7、N9基因)浓度均为100拷贝/μL时,仍可同时检测出。该法对150份临床样品的检测结果与病毒分离鉴定一致。结论本研究建立的同时鉴别诊断h7亚型和5种亚型AIV GeXP高通量检测方法具有特异性强、敏感性高、快速和简便等优点,为防控AIV提供新型检测方法。

摘要：为了对致病性强、危害性大的h5、h7、h9亚型禽流感病毒进行同时集成化快速检测,通过对GenBank已报道的禽流感病毒的hA基因进行序列分析比较,设计了h5、h7、h9 3个亚型的特异性引物和分别用3个荧光基团标记的Taqman MGB核酸探针。将各个亚型引物与探针优化组合,筛选出能够同时检测禽流感病毒h5、h7、h9 3个亚型、且对Ct值和扩增效率影响不大的3组引物和探针,建立了三重实时荧光RT-PCR方法。该方法特异性好,在我们检测的样品中,没有发现假阳性和假阴性现象。同时敏感性高,检测禽流感病毒h5、h7、h9亚型的敏感性分别达到1 0001、000、500个模板拷贝数;此外抗干扰能力强,对禽流感h5、h7、h9 3个亚型的不同模板浓度进行组合,仍可有效地同时检测3个病毒亚型。所建立的方法对保存的89个禽流感病毒样品进行检测,结果与经典检测方法(病毒分离鉴定、hA、hI)的符合率达100%。用上述建立的方法与鸡胚分离法同时对新鲜采集的4 000多份临床样品进行检测,两种方法的检测结果符合率为100%。

摘要：利用多重反转录聚合酶链式反应同时检测h5、h7和h9亚型禽流感病毒.在GenBank中搜索h5、h7和h9亚型禽流感病毒(AIV)的血凝素基因序列,并利用DNAStar软件分析其相似性,利用Primer Premier 5.0软件设计3对分别针对AIV h5、h7和h9亚型的特异性引物.这3对引物所扩增的cDNA片段大小分别为427、228和830 bp.结果表明,通过对多重RT-PCR扩增条件的优化,建立了同时检测h5、h7和h9亚型AIV的多重RT-PCR技术.该多重RT-PCR对h5、h7和h9亚型AIV能同时扩增出3条大小分别为427、228和830 bp的cDNA片段,与其他常见禽病病原的核酸不存在交叉反应.该多重RT-PCR对h5、h7和h9亚型AIV cDNA的最低检出量分别为10 pg、1 ng和10 pg.

摘要：参考GenBank登录的h5、h7和h9亚型禽流感病毒(AIV)的血凝素基因序列,利用DNAStar软件分析其同源性,利用Primer Premier5.0软件设计3对分别针对AIVh5、h7和h9亚型的特异性引物。3对引物所扩增的cDNA片段大小分别为427、228、830bp。结果显示,利用3对引物,通过对多重RT-PCR扩增条件的优化,建立了同时检测h5、h7和h9亚型AIV的多重RT-PCR技术。该方法对h5、h7和h9亚型AIV能同时扩增出3条大小分别为427、228、830bp的cDNA片段,与其他常见禽病病原不存在交叉反应。该方法对h5、h7和h9亚型AIVcDNA的最低检出量分别为10-4、10-2和10-4。结果表明,本试验建立了可同时检测鉴别h5、h7和h9亚型AIV的多重RT-PCR技术。