摘要：目的构建一种含h7n9禽流感病毒全长血凝素/神经氨酸酶/基质蛋白(hA/nA/M)基因的重组质粒,为核酸检测方法提供一种通用的阳性定量标准品。方法设计h7n9禽流感病毒hA、nA及M抗原基因全长开放阅读框的克隆引物,提取h7n9禽流感病毒总RnA后用实时荧光定量PCR获得相应片段,用3次酶切连接方法,依次插入到pGEM-T easy质粒,进行测序确认;线性化后的重组质粒用T7 RnA聚合酶进行体外转录,RnA转录产物纯化后测定浓度,用实时荧光定量PCR构建标准曲线进行验证。结果 hA、nA和M基因扩增片段大小分别约为1.7、1.3、1.1 kb,与预期相符;构建的重组质粒pGEM-hA-nA-M插入片段的测序结果与GenBank公布序列一致;由重组质粒体外转录获得同时含有h7n9禽流感病毒hA、nA、M全长开放阅读框序列的RnA片段质量浓度为399.5 ng/μL,梯度稀释后用3种实时荧光定量PCR方法均获得了良好的标准曲线。结论成功构建重组质粒pGEM-hA-nA-M,由此质粒体外转录获得的RnA片段可作为h7n9禽流感病毒核酸快速检测方法通用的阳性定量标准品。

摘要：目的利用慢病毒载体构建新型h7n9禽流感病毒血凝素(hA)基因的快速真核表达体系,在人胚肾细胞(hEK293T)中表达并进行功能鉴定。方法提取h7n9禽流感病毒基因组RnA,采用反转录PCR技术扩增hA读码框全长基因,将hA基因连接pMD18-T载体构建pMD18-T-hA重组载体。设计含Kozak序列的引物从pMD18-T-hA质粒中扩增出平末端hA基因,采用Topo克隆构建表达载体pLenti-hA-V5。将表达载体转染hEK293T细胞,通过间接免疫荧光法(IFA)和Western blot法鉴定hA蛋白的表达,通过血凝实验鉴定重组蛋白的生物学活性。结果经反转录PCR获得1 683 bp的hA全长基因,完成真核表达载体的构建并表达出相对分子质量(Mr)为70 000的重组蛋白。IFA和Western blot法结果显示该蛋白与阳性血清具有良好的免疫反应,同时血凝实验证实其具有血凝活性。结论成功利用慢病毒载体建立了hA蛋白的快速真核表达系统,为研制h7n9病毒亚单位疫苗、中和表位研究、假病毒包装奠定基础。

摘要：目的 分析浙江省2013年4月初一例人感染甲型h7n9禽流感患者的病原学和基因组序列特征.方法 提取患者标本的病毒RnA并用荧光定量RT-PCR方法检测,一步法RT-PCR扩增h7n9禽流感病毒基因组的8个片段,测序并拼接出基因组序列.下载目前已经公布的h7n9禽流感病毒和其他h7、n9亚型的病毒的hA和nA序列,采用Mega 5.1软件对其进行序列比对并构建进化树.根据测序的结果分析该例h7n9禽流感病毒的序列变异情况.结果 该患者标本甲型流感、h7亚型和n9亚型均为阳性,通过扩增基因组各片段并进行测序.对血凝素和神经氨酸酶基因进行比对和进化树构建,结果显示该h7n9病毒hA基因与A/duck/Zhejiang/12/2011（h7n3）的亲缘关系最近,nA基因与A/wild bird/Korea/A14/2011 （h7n9）的亲缘关系最近.编码内部蛋白的6个基因均与中国大陆近两年的h9n2毒株最为相似.该标本的病毒hA蛋白发生了Q226L突变,而与已经公布的人感染h7n9禽流感毒株均不一致的是PB2未发生E627K突变.结论 从该份临床标本完成了检测和基因组各片段的扩增与测序.该病毒与已报道的人感染h7n9禽流感病毒同源性高,存在Q226L等重要位点的突变,但PB2未发生E627K突变.

摘要：常规PCR方法不适宜于实验条件不足的基层现场检测h7n9禽流感病毒,不利于疑似病例的及时诊治。本研究旨在建立一种快速简便、高灵敏度、低成本的h7n9禽流感病毒快速核酸检测技术。选用h7n9禽流感病毒血凝素(hemagglutinin,hA)基因作为靶标区域设计引物,采用FITC和Biotin标记上下游引物,通过逆转录解旋酶依赖性等温扩增(Reverse transcription helicase-dependent isothermal amplification,RT-hDA)技术扩增病毒RnA,辅以胶体金免疫层析试纸检测核酸扩增产物,建立h7n9禽流感病毒等温扩增检测方法。采用h7n9禽流感病毒质粒和病毒培养物对该方法的灵敏性、特异性和重复性进行评价,结果显示:病毒最低检测限20个拷贝数/μL,与常规PCR方法相比较无明显差异,重复性试验一致,与其他型别的禽流感、流感病毒无交叉反应。本研究建立的RT-hDA联合胶体金免疫层析试纸检测h7n9禽病毒检测方法具有较好的灵敏度、特异性和重复性,特别适用于现场条件下检测h7n9禽流感病毒快速简便的检测。

摘要：目的应用Taq Man探针实时荧光RT-PCR技术,建立一种快速检测h7n9禽流感病毒的方法。方法针对h7n9禽流感病毒的hA和nA基因分别设计特异性引物和Taq Man-LnA探针,建立h7n9禽流感病毒特异性实时荧光RT-PCR快速检测方法。结果本研究建立的方法对检测h7n9禽流感病毒株的灵敏度达到10 PFU/ml。该方法特异性强,与其他亚型流感病毒株及呼吸道病原体无交叉反应。与对照方法相比,本研究方法的检测阳性符合率为99.07%,阴性符合率为100%,Kappa值为0.993。结论建立的检测试剂盒具有快速灵敏、结果准确可靠等优点,适用于h7n9禽流感病毒的分子生物学检测和监测。

摘要：目的利用真核表达载体构建h7n9禽流感病毒血凝素刺突茎部(hA2)的真核表达质粒,在293F细胞中表达hA2蛋白,并初步探讨其免疫原性。方法根据pMD18-T-hA中的序列设计h7n9禽流感病毒hA2扩增引物,在下游引物中引入胰酶酶切位点;目的基因经特异性酶切位点克隆入自身带有Fc标签的pFUSE-IgG1-Fc1载体,构建重组质粒hA2-Fc;将重组质粒转染293F细胞,通过间接免疫荧荧光(IFA)和免疫印迹法(WB)鉴定hA2蛋白的表达和免疫原性。结果成功构建h7n9禽流感病毒hA2基因真核表达质粒hA2-Fc,并在293F细胞中表达出分子量大约为50kDa的重组蛋白。IFA和WB显示该蛋白与抗h7n9病毒鼠多抗具有良好的免疫反应。结论成功构建表达hA2亚单位的真核表达系统,重组蛋白具有较高的免疫原性,为筛选h7n9广谱疫苗候选分子、广谱中和抗体,及深入研究其致病机理和免疫机制奠定基础。

摘要：随着h7n9禽流感病毒开始蔓延,一些医学者开始对h7n9禽流感病毒的检测方法进行研究,逐渐提出了RT-PCR检测方法、实时荧光RT-PCR检测方法、三重PCR检测方法、纳米荧光颗粒试纸条检测方法和nASBA检测方法等,其中,实时荧光RT-PCR检测方法是目前为止较为成熟的检测方法。该方法是根据h7n9亚型禽流感病毒hA和nA核苷酸序列,设计并合成靶基因为hA和nA的2对引物而建立的1种快速检测h7n9亚型禽流感病毒的方法。基于此,介绍1种快速检测h7n9亚型禽流感的方法——实时荧光RT-PCR检测方法。

摘要：目的建立h7n9禽流感病毒一步法逆转录重组酶介导的等温扩增的检测方法(RT-RAA)。方法根据h7n9禽流感病毒hA片段和nA片段的保守区序列分别设计引物、探针,建立RT-RAA方法,研究其特异性、敏感性,并与Realtime RT-PCR方法进行比较。结果成功建立了h7n9禽流感病毒RT-RAA检测方法,h7反应体系和n9反应体系的最低检出限分别为10copy/μL和100copy/μL,且与其他呼吸道病原无交叉反应。h7n9RT-RAA体系检测结果与Real-time RT-PCR一致性较高,Kappa检验u系数为0.933。结论建立的RT-RAA检测方法具有快速、特异及灵敏的特点,为h7n9禽流感病毒的快速检测提供了新的分子工具。

摘要：目的建立检测h7n9禽流感病毒基因的逆转录环介导等温扩增(reverse transcription Loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)方法,并初步评估应用。方法设计、合成h7n9禽流感病毒血凝素(hA)基因、神经氨酸酶(nA)基因的引物组,通过优化参数,建立RT-LAMP反应体系,使用梯度稀释的标准品测试该体系检测灵敏度,并使用对比毒株测试特异性,再对142份临床标本进行实样检测。结果成功建立了检测h7n9禽流感病毒hA基因、nA基因的RT-LAMP方法,可直接肉眼观察判读结果,检测其hA基因、nA基因的敏感性分别达到10拷贝每反应、5拷贝每反应,对其他常见呼吸道病原无交叉反应;在测序证实阳性的临床样本中,对于病毒hA基因、nA基因检出率分别为100%、92.68%。结论逆转录环介导等温扩增技术检测h7n9禽流感病毒基因,具有简单、快速、灵敏度高,检测结果可视化,无需特殊设备等优点,在禽流感病原监测上有一定应用前景。

摘要：目的分析2013年4月浙江省人感染h7n9禽流感确诊病例的临床与流行病学特征，探讨其临床特征、感染重点地区和人群及危险因素。方法采用实时荧光定量PCR检测病例和密切接触者咽拭子h7n9禽流感病毒核酸；采用流行病学个案调查与描述性流行病学相结合方法，收集与分析6例确诊病例的临床与流行病学相关资料；采用SPSS17．0软件进行统计分析。结果6例人感染h7n9禽流感确诊病例主要分布在杭州和湖州地区，平均年龄60．83（M=64．50）岁，男性多于女性（5：1）；咳嗽常为首发症状，主要临床表现有发热、头晕、肌肉酸痛、咳嗽、咳痰以及气促、呼吸困难等，胸部影像学均显示严重肺炎，大部分病例（5／6）有慢性基础性疾病。所有病例均无病（死）禽暴露史，但有高频度农贸市场暴露史，其暴露的农贸市场外环境标本h7n9禽流感病毒核酸阳性率达43.21％。6例病例的375名密切接触者中有32人（8．53％）出现异常症状，但咽拭子h7n9禽流感病毒核酸检测均为阴性。结论人感染h7n9禽流感以急性呼吸系统损害为主要临床表现；老年男性，特别是有慢性基础性疾病者是浙江省人感染h7n9禽流感病例的危险人群，其感染来源可能与禽类暴露有关，暂无充分证据支持病毒的人际传播。