摘要：通过分析流感数据库中123个hA序列,根据hA保守区序列设计并合成了1对引物,建立了一步法RT-PCR检测方法,预期扩增片段大小为732 bp。通过对h9亚型禽流感病毒（AIV）不同稀释度的尿囊液和棉拭子浸出液进行检测,证实病毒尿囊液的最低检出量为1×10^4.7EID50/mL;阳性棉拭子的最低检出量为1×10^2.5EID50/mL。用该方法检测h1-h15亚型AIV和鸡新城疫病毒等其他14种禽病病原,结果仅有h9亚型AIV出现特异性目的条带,而其他均未出现目的条带。脏器及咽喉、泄殖腔棉拭子样品在1∶10稀释度下,病毒分离和RT-PCR方法可以达到相同的阳性检出率。表明建立的AIV h9亚型RT-PCR方法具有较好的特异性和敏感性。

摘要：h9亚型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)是危害我国养禽业的主要病毒之一,造成了严重的经济损失。根据h9亚型AIV的hA基因设计了1对引物,建立了h9亚型禽流感病毒的RT-PCR鉴定方法。h9亚型AIV的hA基因预期扩增的目的片断长度为425 bp。对h9N2亚型禽流感病毒不同稀释度的尿囊液进行检测,证实病毒尿囊液的最低检出量为1×10^(4.25)EID_(50)/100μL。建立的RT-PCR检测方法对h9、h3、h4、h5亚型AIV及新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒等进行检测,结果仅有h9N2亚型AIV出现特异性目的条带,其他均未出现目的条带,与其他常见禽病病原无交叉反应;用建立的RT-PCR和病毒分离2种方法同时对10株h9N2亚型AIV和8个病鸡组织的鸡胚尿囊液样品进行检测,结果 2种检测方法的符合率达100%。说明该鉴定方法特异性强,敏感性较高。

摘要：根据h9亚型禽流感病毒hA基因上的保守序列,设计合成引物,以阳性h9亚型禽流感病毒hA基因重组质粒为标准品做标准曲线,建立了荧光定量逆转录聚合酶链反应检测方法。结果表明:本试验建立的标准曲线循环阈值(Ct值)与模板浓度具有良好的线性关系,相关系数为0.997,灵敏度约为6拷贝/μL,对新城疫病毒和其他禽病病毒无交叉反应,特异性好,重复性佳,对193份临床泄殖腔棉拭样品的检测,其结果与经典病毒分离方法符合率大于90.0%。该方法为h9亚型禽流感病毒检测提供了一种特异、敏感、快速、较便宜、高通量、生物安全性好的定量检测手段,将在禽流感病毒临床样品快速筛检、流行病学监测等方面显示良好的应用前景。

摘要：h9亚型禽流感在我国家禽中广泛流行,给养禽业造成巨大经济损失的同时,也严重威胁着公共卫生安全。h9亚型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)具有高度遗传变异性,导致流行株和疫苗株之间抗原匹配性差,从而影响疫苗的临床保护效果,急需研发一种高效、具有交叉保护性的通用型h9亚型禽流感疫苗。马赛克疫苗是针对遗传多样性病原体设计,通过整合所有抗原序列获得一条抗原表位覆盖最广泛的嵌合蛋白,并制备疫苗。本研究参考mosaic疫苗设计原则,设计、优化并合成了一条h9亚型禽流感病毒的mosaic血凝素(hemagglutinin,hA)基因序列,采用反向遗传操作技术,以h1N1亚型流感病毒PR8株为骨架,以mosaic h9 hA序列替换PR8株的hA片段,获得重组病毒rPR8-hAm/h9。将其制备为灭活疫苗并免疫SPF雏鸡,监测抗体水平、攻毒保护效果,评价其交叉保护效果。结果表明,重组病毒rPR8-hAm/h9灭活疫苗免疫SPF雏鸡,可诱导机体产生较高水平的hI抗体和中和抗体,可显著抑制攻毒后病毒的脱落,对h9N2 AIV JM0305株的攻毒保护率为80%。rPR8-hAm/h9灭活疫苗可以对异源h9N2 AIV JM0305株产生较好的交叉攻毒保护,为研发基于马赛克技术的禽流感通用疫苗提供了前期基础。

摘要：为了对致病性强、危害性大的h5、h7、h9亚型禽流感病毒进行同时集成化快速检测,通过对GenBank已报道的禽流感病毒的hA基因进行序列分析比较,设计了h5、h7、h9 3个亚型的特异性引物和分别用3个荧光基团标记的Taqman MGB核酸探针。将各个亚型引物与探针优化组合,筛选出能够同时检测禽流感病毒h5、h7、h9 3个亚型、且对Ct值和扩增效率影响不大的3组引物和探针,建立了三重实时荧光RT-PCR方法。该方法特异性好,在我们检测的样品中,没有发现假阳性和假阴性现象。同时敏感性高,检测禽流感病毒h5、h7、h9亚型的敏感性分别达到1 0001、000、500个模板拷贝数;此外抗干扰能力强,对禽流感h5、h7、h9 3个亚型的不同模板浓度进行组合,仍可有效地同时检测3个病毒亚型。所建立的方法对保存的89个禽流感病毒样品进行检测,结果与经典检测方法(病毒分离鉴定、hA、hI)的符合率达100%。用上述建立的方法与鸡胚分离法同时对新鲜采集的4 000多份临床样品进行检测,两种方法的检测结果符合率为100%。

摘要：根据禽流感病毒h5、h9亚型的hA基因序列 ,设计了两对RT_PCR引物 ,同时对h5、h9亚型进行了多重RT_PCR扩增 ,得到了两条清晰的目的带。将目的带回收并进行测序 ,同源性比较结果证明其为禽流感h5、h9亚型的hA基因序列 ,作者对多重RT_PCR进行反应条件优化以及敏感性与特异性测定 ,证明该方法的敏感性和特异性都比较好。初步应用于 30份临床病料 ,其检测结果与病毒的分离培养一致 ,比电镜和琼扩的检出率高 ,与其他NDV、IBV的病料无交叉反应 ,可用于禽流感病毒h5。

摘要：为了快速、敏感、特异地鉴别诊断我国目前流行的禽流感,根据h5、h9亚型禽流感病毒hA基因序列的保守区域设计并合成2对特异性引物,利用这2对引物对h5、h9亚型禽流感病毒的hA基因片段进行二联RT-PCR扩增,并对二联RT-PCR检测方法进行了敏感性及特异性试验。结果表明,这2对引物能特异地扩增h5、h9亚型禽流感病毒hA基因片段,大小分别为490bp和686bp;该检测方法敏感性高,特异性强;初步建立起快速、敏感、特异地鉴别检测h5、h9亚型禽流感病毒的分子诊断方法。

摘要：利用多重反转录聚合酶链式反应同时检测h5、h7和h9亚型禽流感病毒.在GenBank中搜索h5、h7和h9亚型禽流感病毒(AIV)的血凝素基因序列,并利用DNAStar软件分析其相似性,利用Primer Premier 5.0软件设计3对分别针对AIV h5、h7和h9亚型的特异性引物.这3对引物所扩增的cDNA片段大小分别为427、228和830 bp.结果表明,通过对多重RT-PCR扩增条件的优化,建立了同时检测h5、h7和h9亚型AIV的多重RT-PCR技术.该多重RT-PCR对h5、h7和h9亚型AIV能同时扩增出3条大小分别为427、228和830 bp的cDNA片段,与其他常见禽病病原的核酸不存在交叉反应.该多重RT-PCR对h5、h7和h9亚型AIV cDNA的最低检出量分别为10 pg、1 ng和10 pg.

摘要：旨在提高对禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)检测效率,及时发现疫病。本研究通过分析M基因以及h5、h7和h9亚型的hA基因序列保守区域,设计并合成了相关探针和引物,建立了禽流感病毒(AIV)四重荧光RT-PCR检测方法,该方法可在检测禽流感病毒(AIV)的同时,确定病原是否为h5、h7和h9亚型。结果显示,该检测方法耗时短、特异性好、检测下限达到10^-5 ng·μL^-1。采用该方法检测临床采集的13个活禽交易市场的384份禽咽喉和泄殖腔双拭子样品,经检测,其中有60份样品为流感病毒阳性,且全部是h9亚型,该结果与行业标准方法(NY/T 772-2013)检测结果一致,κ值为1(P<0.001)。本方法能实现对禽流感病毒及h5、h7和h9亚型的高通量快速检测,将在AIV快速检测中发挥重要作用。

摘要：目的参考AIV M基因和hA基因序列,设计了两对引物。其中XZ145-2和XZ146为通用引物,可以检测所有亚型AIV,跨幅244 bp;XZ h9-1和XZ h9-2为h9亚型特异性引物,跨幅488 bp。方法利用这两对引物,通过对多重RT-PCR扩增条件的优化,成功建立了快速检测鉴别h9亚型AIV的多重RT-PCR技术。结果与结论特异性和敏感性试验结果表明,该技术对h9亚型AIV同时扩增出两条大小分别为244 bp和488 bp的cDNA片段,对其他亚型AIV只扩增出244bp的cDNA片段,对其他常见禽病病原无特异性扩增,结果为阴性;该多重RT-PCR的通用引物对AIV RNA的最低检出量为1pg,对h9亚型RNA的最低检出量为10 pg。