摘要：采用双重荧光实时RT-PCR技术,建立一种简便易行的h9n2亚型禽流感病毒的快速鉴定方法。通过比对GenBank甲型禽流感病毒h9n2亚型的hA和nA基因序列,设计特异性针对hA和nA的引物,分别选用FAM和JOE两种不同荧光标记探针,构建双重实时荧光PCR一步法反应体系,同时检测样本中的hA和nA基因。结果显示:扩增曲线和特异性实验结果显示,该体系具有很好的扩增效率,且仅特异性识别h9n2亚型AIV的hA、nA基因,与相关病毒或其他亚型无交叉反应。采用重组质粒pMD19-T构建hA、nA阳性质粒,10倍梯度稀释液为模板,进行荧光定量PCR。结果证实,本研究所建立的双重荧光定量RT-PCR体系敏感性能达到10个RnA拷贝数。采用本方法检测60份感染动物样品及60份环境样品,与传统PCR方法相比,检测敏感性提高了100倍;与病毒分离鉴定方法比较,二者的鉴定结果完全吻合。该方法具有特异性强、灵敏度高、快速易操作等优点,是h9n2亚型禽流感病毒鉴定的有效方法。

摘要：建立以Sanger测序为基础的h9n2亚型禽流感病毒全基因组测序方法。从GenBank和GISAID数据库中选取2000至2012年中国地区和中国国家流感中心病毒序列数据库中h9n2亚型禽流感病毒的8个片段基因序列,通过比对分析在相对保守的区域设计分段扩增引物,共16对。选用1株病例分离毒株和4株环境分离毒株对引物进行验证和进一步优化。优化后的16对引物能够有效扩增5株h9n2亚型禽流感病毒,仅个别反应出现非特异扩增。所有获得的目的片段仍能有效进行后续测序实验。建立了一种能够有效获得新型重配h9n2亚型禽流感病毒全基因组序列的Sanger测序方法,为该病原分子流行病学研究和开展风险评估提供技术支撑。

摘要：【目的】对h9n2禽流感病毒hA基因全序列进行分析,了解h9n2禽流感分离毒株hA基因的遗传变异情况。【方法】根据GenBank已发表的h9n2毒株的基因序列,设计了2对h9n2禽流感病毒hA基因特异性引物,运用RT-PCR方法对XL、LF和Wn分离株进行了扩增,然后将PCR产物送出进行测序,用DnAstar 5.0软件对测序结果进行了分析。【结果】XL、LF和Wn 3株h9n2分离株间hA基因的核苷酸同源性为99.7%-99.9%,推导氨基酸的同源性为99.1%-99.6%;分离株与参考毒株hA基因核苷酸的同源性为96.2%-99.0%,推导氨基酸的同源性为96.2%-98.6%。通过对3个h9n2分离株间hA基因核苷酸序列的比较,发现共有5个位点的核苷酸发生突变,其中4个位点核苷酸的改变导致相应的氨基酸发生突变。hA蛋白的7个受体结合位点比较保守,但是其在551-553位缺失了潜在的糖基化位点。【结论】3株h9n2分离株裂解位点氨基酸序列完全符合低致病性禽流感的特征RSSR↓G,但是LF裂解位点附近333位脯氨酸（Pro）突变为组氨酸（his）,即非极性氨基酸向极性带正电氨基酸（碱性氨基酸）转变,裂解位点的变化可能是h9n2禽流感病毒生物学特性改变的分子基础。

摘要：[目的]测定h9n2 AIV4个毒株血凝素基因序列,并进行比较分析,从分子生物学角度了解各毒株间的差异和变异规律,进而了解该亚型禽流感的分布及流行规律。[方法]参照h9n2亚型禽流感hA基因序列设计1对引物,对禽流感A/Chicken/hebei/WD/98(h9n2)、A/Chiken/hebei/ZD/04(h9n2)、A/Chicken/Beijing/MY/06(h9n2)和A/Chicken/Beijing/PG/08(h9n2)4个毒株hA基因进行扩增、克隆和测序,并将这4个毒株的hA基因序列分别与GenBank登录的10个h9n2亚型禽流感毒株进行比较分析。[结果]获得了4个毒株hA基因(ORF)全长1 683 bp,编码561个氨基酸;4个毒株之间的核苷酸和氨基酸同源性分别为92.5%～95.6%和95.2%～96.8%;WD株、MY株、PG株和ZD株与其他10个毒株的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为82.6%～95.1%、83.0%～99.0%、82.7%～95.5%、81.30%～95.7%、86.6%～96.3%、86.6%～97.9%、87.0%～97.1%、86.9%～97.3。[结论]hA基因在不同毒株间具有很高的同源性。

摘要：h9n2亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)是我国主要流行的低致病性禽流感病毒亚型,因而对其进行病毒的监测与诊断显得极其重要。通过比对GenBank上h9亚型禽流感病毒hA基因序列,设计了一个特异性针对h9 AIV hA的探针。特异性和扩增曲线实验结果显示,该探针具有较好的扩增效率,且仅特异性识别h9亚型AIV。通过重组质粒pMD19-T-h9hA 10倍梯度稀释液为模板,进行荧光定量PCR。实验结果表明,本研究所建立的荧光定量PCR方法敏感性能达到100个DnA拷贝数,比传统PCR方法检测敏感性提高了1000倍。此外,本方法还能检测到10EID50个病毒,比传统PCR方法检测敏感性也提高了1000倍。通过批间和批内试验,结果表明,这两个试验的变异系数分别小于5%和1%,说明本研究的方法具有较好的重复性。此外,通过检测人工感染动物咽拭子,结果表明h9亚型AIV荧光定量PCR方法比传统PCR的方法检测敏感性提高了100倍。在临床样品的检测中,h9亚型AIV荧光定量PCR方法检测的阳性率比传统PCR法检测的阳性率提高了大约30%。综上所述,本研究所建立的h9n2亚型禽流感病毒荧光定量PCR方法具有较高的特异性、准确性和敏感性,对h9亚型禽流感疫情防控及其流行病学调查具有积极的科学意义。

摘要：[ Objective] To determine the hA gene sequences of four h9n2 Avian influenza virus （AIV） strains and carry out comparative analysis so as to understand the difference and variation pattern of each strain from the angle of molecular biology and to know the distribution and epidemic law of h9n2 AIV. [Method] One pair of primers was designed referring to hA gene sequences of h9n2 AIV. The hA genes of A/Chicken/hebei/WD/98 （h9n2; WD98 for short）, A/Chicken/hebei/ZD/04 （h9n2; ZD04 for short））, A/Chicken/Beijing/MY/06 （h9n2; MY06 for short） ）, and A/Chicken/Beijing/PG/08 （h9n2; PG08 for short）） were amplified, cloned and sequenced. Then the hA gene sequences of these strains were compared with that of 10 h9n2 AIV stains in GenBank. [Result] The ORF of hA genes of the four strains was 1 683 bp in size, encoding 516 amino acids. The hA gene sequences of the four strains, WD98, MY06, PG08, and ZD04, were 82.6% -95.1%, 83.0% -99.0%, 82.7% -95.5%, and 81.3% -95.7% homologous to that of the 10 h9n2 AIV stains, respectively. And the homology of amino acid was respectively 86.6% -96.3%, 86.6% -97.9%, 87.0% -97.1%, and 86.9% -97.3%. [ Conclusion] The hA gene has greatly high homology among different strains.

摘要：根据GenBank已发表序列设计引物,通过RT-PCR成功获得了h9亚型禽流感病毒北京分离株A/Chicken/Beijing/1/96(h9n2)的hA1片段,经序列分析hA1片段与其他已发表序列同源性为95%～98%。将hA1片段克隆入pET-28a的多克隆位点构建重组质粒pET28-h9hA1并转化宿主菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达,经SDS-PAGE电泳及Western blot分析证实,h9hA1片段得到表达,并且表达的蛋白带分为42Ku和23Ku两条。血凝实验和血凝抑制实验表明原核表达的hA1蛋白不具备血凝活性,其阳性血清不能引起血凝抑制。交叉反应实验证实原核表达的重组蛋白能与禽流感病毒h9亚型单特异性血清反应,而与禽流感病毒h5、h7亚型以及其他禽传染病病原微生物单特异性血清无交叉反应。说明表达的蛋白具有良好的反应原性和特异性,有开发成为h9亚型禽流感检测试剂的可能。