摘要：为建立h9n2亚型禽流感病毒(AIV)抗体快速、高效的血清学检测方法,参考GenBank数据库中h9n2 AIV的hA基因序列(登录号:MK995886.1)设计并合成特异性引物,以h9n2 AIV RnA为模板,RT-PCR扩增目的基因hA1,构建pET28a-hA1重组质粒,经原核系统表达获得hA1蛋白。通过SDS-PAGE和Western-blot鉴定蛋白表达和反应原性,用纯化后的hA1重组蛋白作为包被抗原建立间接ELISA方法。结果显示,该检测方法抗原最佳包被浓度为0.2μg/mL,血清最佳稀释度为1∶160,用1%BSA溶液37℃封闭60 min效果最佳,酶标二抗最佳稀释度为1∶6 000,具有较高的特异性、灵敏性和符合率。上述结果表明,本试验成功表达并纯化了h9n2 AIV的hA1蛋白,建立的间接ELISA检测方法为h9n2 AIV的流行病学调查、免疫效果评价及临床诊断试剂盒的开发奠定了基础。

摘要：根据GenBank登陆的h9n2亚型AIV全基因组序列,设计了8对引物,运用RT-PCR的方法获取了3株h9n2亚型AIV西藏分离株A/Chiken/Tibet/S1/2009、A/Duck/Tibet/S2/2009和A/Chiken/Tibet/S4/2009的8个基因序列,并对所得序列进行同源性及遗传进化分析。结果显示,分离毒株的各基因片段均有完整的开放阅读框,hA基因裂解位点处均为RSSR/G,符合低致病性禽流感的特征;3株西藏分离毒株之间同源性为98%~99%,可能起源于同一种系;各分离毒的hA、nS和nA基因与欧亚分支A/Chiken/Beijing/1/94分支中的A/Duck/hongKong/Y280/97遗传距离最近,而M、nP、PA、PB1和PB2基因与欧亚分支中另一分支A/Quail/hongKong/G1/97群系遗传关系近。由此可见3株分离株的各基因所属分支不具有统一性,说明本研究所分离的3株h9n2亚型AIV西藏分离毒株可能是来源于不同亚系AIV的毒株在感染同一种宿主时发生基因重排的产物。

摘要：根据GenBank中已发表的h9n2亚型AIV hA基因序列设计并合成一对PCR引物,通过RT-PCR扩增A/Chicken/Shanghai/3/2002(h9n2)AIV毒株的hA基因,测序确认后,将其克隆入真核表达载体pVAX1和asd-pVAX1得到重组表达质粒pVAX1-hA和asd-pVAX1-hA。将重组质粒转染COS-7细胞,经间接免疫荧光试验证实,hA基因在细胞内得到了瞬时表达。进一步将重组质粒转化减毒鼠伤寒沙门菌SL7207和X4550,得到两种运送DnA疫苗的重组沙门菌SL7207(pVAX1-hA)和X4550(asd-pVAX1-hA)。以5×109cfu/只的剂量两次口服接种1日龄的商品代伊莎褐蛋鸡,免疫鸡既能检测到hA特异性的血清抗体应答,又能检测到黏膜免疫应答,采用A/Chicken/Shanghai/3/2002(h9n2)AIV毒株经滴鼻和口服同时攻毒免疫鸡后,这两种疫苗抑制免疫鸡排毒的效果与灭活疫苗有显著差异。

摘要：为建立鸭h9n2亚型禽流感病毒的监测及临床诊断方法,根据鸭源h9n2亚型禽流感病毒hA蛋白的基因序列设计1对特异性PCR引物,并以鸭源h9n2亚型禽流感病毒基因组为模板,建立鸭源h9n2亚型禽流感病毒的特异性RT-PCR检测方法,并用该方法对江苏省多地采集的疑似病料进行检测,扩增产物经测序鉴定后判断建立的方法对临床样品的检出率。结果显示,该方法可以特异性扩增鸭源h9n2亚型禽流感病毒hA蛋白基因保守区的837 bp的序列,与对照的病毒无交叉反应,敏感性较好,最低可检测1fg基因组,临床样品的检测率为100%,表明本试验建立的鸭源h9n2亚型禽流感病毒RT-PCR特异性强、敏感性高,可用于临床快速诊断鸭源h9n2亚型禽流感病毒感染。

摘要：为研究鸡体内miRnA-2127对低致病性禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)h9n2复制的影响,本研究将化学合成的gga-miR-2127模拟物和抑制剂分别转染DF-1细胞,接种h9n2亚型病毒,检测细胞中病毒含量变化,发现gga-miR-2127能够显著促进病毒的复制。为探索其中的分子机制,用生物信息学软件预测gga-miR-2127的调控位点位于p53基因mRnA的3′UTR区,并用双荧光素酶报告系统对其靶向关系进行了验证。荧光定量RT-PCR法和Western blot试验表明,gga-miR-2127过表达时p53的mRnA水平不变而p53蛋白表达水平降低,细胞天然免疫机能下降。据此推测gga-miR-2127促进h9n2复制的分子作用机理是在p53基因的mRnA转录后,通过gga-miR-2127与其mRnA的3′UTR区结合,抑制p53蛋白的翻译从而抑制抗病毒作用和细胞的天然免疫机能。

摘要：本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建MAVS基因稳定敲除的细胞株,对流感病毒的增殖特性进行初步研究。设计、构建靶向MAVS基因sgRnA表达载体,与pCAG-Cas9-EGFP表达载体共转染MDCK细胞,经过流式细胞仪分选、PCR、基因测序筛选MAVS敲除细胞系,CCK-8法检测细胞增殖速度;荧光定量PCR方法检测h9n2亚型禽流感病毒(AIV)感染后的TCID_(50)、病毒拷贝数以及IRF3、IFn-β、Mx1基因转录水平变化。结果显示,筛选出1株MAVS基因缺失44 bp的MDCK细胞(MAVS^(-/-)MDCK),其增殖速度与正常细胞相比未观察到显著差异;荧光定量PCR结果表明,TCID_(50)、病毒拷贝数差异最高可分别达到MDCK细胞的4.11倍和1.82倍;MAVS^(-/-)MDCK中IRF3、IFn-β和Mx1 m RnA表达水平显著降低,表明MAVS敲除后抑制了Ⅰ型干扰素信号通路。表明,本研究获得的MAVS^(-/-)MDCK能够促进禽流感病毒的复制,为提高疫苗生产效率和质量提供候选细胞株;该细胞株也为进一步研究MAVS参与抗病毒天然免疫应答奠定基础。

摘要：根据h9n2亚型禽流感病毒(AIV)的nS1基因序列,设计1对特异性引物,采用RT-PCR方法扩增AIV的nS1基因序列,将其克隆到原核表达载体pET-32α(+)中,构建重组表达质粒pET-32α(+)-nS1,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导得到nS1融合蛋白;其相对分子质量约28 000,分析显示nS1基因的原核表达载体成功构建,表达蛋白以包涵体形式存在,包涵体经过变性和复性后均可获得单一、高表达量的目的蛋白,为进一步开展关于nS1蛋白的功能,为建立鉴别禽流感疫苗免疫和野毒感染ELISA诊断试剂盒奠定基础。

摘要：为了研究h9n2亚型禽流感病毒(AIV)在家禽体内各个器官的分布,试验针对h9n2亚型AIV的hA基因设计1对特异性引物,同时设计1对扩增内参基因β-actin的引物,以阳性重组质粒作为标准品做标准曲线,建立荧光定量RT-PCR检测方法,并对人工感染h9n2的SPF雏鸡气管、胸腺、肺脏、肝脏、脾脏、肾脏、肠等器官进行3次重复检测。结果表明:该法线性关系R值均在0.99以上,检测极限均为10拷贝质粒DnA,比RT-PCR灵敏100倍以上;特异性好,批内和批间重复性试验变异系数均小于1%。通过比较各器官hA相对表达量,得出肠和胰腺中hA相对表达量最高,腺胃次之,脾脏、肝脏、胸腺、法氏囊中含量也比较高,气管、肺脏、肾脏中含量较低,其中肾脏含量最低。说明研究建立的h9n2亚型禽流感病毒荧光定量RT-PCR方法灵敏度高,特异性强。

摘要：利用CRISPR/Cpf1基因编辑技术构建DDX21基因稳定敲除的细胞株,并检测其生物学功能。设计、构建靶向DDX21基因向导RnA表达载体,与Cpf1表达载体共转染hEK293细胞,通过流式筛选、基因测序、Western blot和细胞增殖能力检测鉴定细胞株;荧光定量PCR检测病毒感染后模式识别受体(TLR-3、TLR-7、MDA-5)、Ⅰ型干扰素、IL-6以及抗病毒蛋白OAS mRnA水平表达情况。结果显示:成功筛选到2株DDX21基因敲除的细胞株,蛋白免疫印迹显示DDX21蛋白不表达;与野生型(wild type,WT)相比敲除株形成细胞单层的时间明显延长(P<0.01);h9n2亚型禽流感病毒感染试验表明,模式识别受体TLR-3、MDA-5的mRnA表达水平上调,TLR-7表达水平无明显差异,IFn-α、IFn-β、IL-6及抗病毒蛋白OAS的mRnA表达水平下调,表明DDX21基因敲除阻断了DDX21-TRIF-MyD88信号通路;TCID50测定结果显示,差异最高可达到WT的3.01倍,表明DDX21基因敲除后流感病毒复制增加。本研究利用CRISPR/Cpf1系统获得2株DDX21基因稳定敲除的hEK293细胞株,为深入研究DDX21基因功能、病毒感染的天然免疫应答和调控研究奠定理论基础。