摘要：目的研究siRNA对大鼠心肌半胱亚磺酸脱羧酶(cSD)的抑制作用。方法根据已克隆的大鼠心肌cSD基因序列(EU786150)设计并构建了4个siRNAs及1个阴性对照siRNA表达质粒,利用脂质体LipofectamineTM2000将构建好的重组质粒siRNA1#、siRNA2#、siRNA3#、siRNA4#及阴性对照质粒分别转染h9c2细胞,应用荧光显微镜观察转染效率、四唑盐(MTT)法检测h9c2细胞增殖情况、实时荧光定量PcR和Western-blot检测cSD mRNA和蛋白表达。结果荧光显微镜观察细胞转染效率达70%左右;与阴性对照组、未转染组比较,siRNA1#重组质粒显著抑制了h9c2细胞中cSD mRNA和蛋白的表达(P0.05);MTT检测结果表明转染重组质粒siRNA1#、siRNA2#进入h9c2细胞48 h、72 h后细胞增殖明显受抑制,与阴性对照组、未转染组相比差异均达到显著水平(P<0.05)。结论 siRNA1#重组质粒能有效抑制cSD基因的表达,且显著抑制h9c2细胞增殖,为研究cSD基因及揭示牛磺酸在心肌细胞代谢中的作用奠定基础。[营养学报,2012,34(4):317-321]

摘要：基因特异性敲除的细胞常用于生物学研究。近些年兴起的cRISPR-cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats-cas9 nuclease)基因编辑技术越来越广泛地用于基因特异性敲除的实验中。本实验通过利用cRISPR-cas9基因编辑技术,实现对大鼠心肌h9c2细胞Tudor-SN(tudor staphylococcal nuclease)基因的敲除,并观察其对h9c2细胞周期及增殖的影响。选择PX462质粒为载体,利用软件设计能特异性识别h9c2细胞Tudor-SN基因第2个外显子的上下游sgRNA(single-guided RNA),构建1对重组质粒。随后,将这对质粒共同转入h9c2细胞中,再挑选阳性单克隆细胞进行培养。Western印迹鉴定其敲除效果,并用敲除成功的细胞株通过流式细胞术及ccK-8(cell counting kit 8)实验进行细胞周期和增殖的检测。Western印迹结果显示,在阳性细胞中,Tudor-SN蛋白不表达,成功实现了对Tudor-SN基因的敲除。流式结果显示,Tudor-SN基因敲除(KO)细胞发生了G1期阻滞。G1期细胞占比由h9c2野生型(WT)细胞的54.28%±0.21%升高到KO细胞的61.96%±0.40%(*P<0.05)。ccK-8实验结果显示,KO细胞的增殖速率减慢。生长第6天的A值由WT细胞的2.82±0.03降低到KO细胞1.85±0.19(*P<0.05)。本实验成功构建了h9c2细胞Tudor-SN基因敲除细胞株,并检测到Tudor-SN基因敲除对细胞周期的阻滞及增殖的抑制,为研究Tudor-SN基因对心肌细胞功能的调控提供了便利的工具及研究的基础。

摘要：目的探讨芍药苷对脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)诱导h9c2细胞氧化应激损伤的作用。方法采用LPS刺激h9c2细胞来检测相应的氧化应激指标从而间接反映细胞损伤程度,通过检测细胞内活性氧团基(reactive oxygen species,ROS)水平的变化来观察芍药苷对其作用。本实验将细胞分为正常对照组、LPS氧化损伤组、LPS加芍药苷组(低、中、高剂量),按实验设计因素处理后,用荧光酶标仪及流式细胞仪检测细胞内ROS水平。结果芍药苷对h9c2细胞具有低毒性,它可以降低胞内ROS的水平,且在本实验使用浓度范围内,芍药苷使细胞内ROS降低呈浓度依赖性;在本实验设计的时间范围内,芍药苷使细胞内ROS下降呈时间依赖性。结论芍药苷对LPS诱导h9c2细胞氧化应激损伤具有明显的改善作用。

摘要：目的:通过高糖条件培养大鼠心肌h9c2细胞模拟糖尿病心肌病(DcM)体外细胞模型,并探讨雷公藤红素对h9c2细胞的保护作用及机制。方法:实验设立低糖组(5.6 mmol/L低糖培养)、等渗组(甘露醇等渗培养)、高糖组(30 mmol/L高糖培养)和雷公藤红素组(高糖培养并加入10 ng/mL和100 ng/mL雷公藤红素干预)。采用MTT法分析高糖组和雷公藤红素组h9c2细胞的活力;应用活性氧簇荧光探针染色法和流式细胞术分析低糖组、等渗组、高糖组和100 ng/m L雷公藤红素组h9c2细胞中ROS产生水平;RT-PcR和Western blot实验技术分析低糖组、等渗组、高糖组和雷公藤红素组h9c2细胞中NF-κB、TGF-1β和IL-1β的mRNA和蛋白表达水平。结果:高糖组中高糖培养条件对h9c2细胞活力有抑制作用,与低糖组和等渗组比差异有统计学意义(P<0.05),雷公藤红素干预可以降低高糖培养对h9c2细胞的生长抑制作用;高糖组细胞内的ROS水平明显高于低糖组和等渗组(P<0.05),100 ng/m L雷公藤红素可抑制细胞内ROS产生;RT-PcR和Western blot结果显示,与低糖组和等渗组相比,高糖组细胞中NF-κB、TGF-1β和IL-1βm RNA和蛋白表达上调,差异有统计学意义(P<0.05);与高糖组相比,10 ng/mL和100 ng/mL雷公藤红素组细胞中的NF-κB、TGF-1β和IL-1β基因mRNA和蛋白表达水平均出现下调,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:雷公藤红素可以明显抑制h9c2细胞在高糖培养条件下ROS的产生水平并降低高糖培养对细胞的生长抑制作用,发挥对心肌细胞的保护作用,其机制可能与抑制炎症因子相关基因的表达有关。

摘要：目的:制备血红素加氧酶-1(hO-1)融合蛋白PEP-1-hO-1,观察融合蛋白在大鼠h9c2心肌细胞的转导。方法:设计合成hhO-1 PcR引物,扩增hhO-1 cDNA片段;采用PcR靶向克隆法将扩增产物与含有相同酶切位点载体质粒pET15b-PEP-1进行重组,扩增质粒,双酶切鉴定和DNA测序;将测序和鉴定结果正确的重组质粒转化宿主菌Rosetta(DE3)pLysS,诱导表达融合蛋白PEP-1-hO-1,利用表达蛋白N端的组氨酸"标签"(his-tag)进行亲和层析纯化融合蛋白;SDS-PAGE和Western blotting对融合蛋白进行定性检测,Bradford法定量检测纯化后蛋白;融合蛋白孵育大鼠h9c2心肌细胞,免疫组化法观察融合蛋白在h9c2细胞的转导和分布,分光度法检测蛋白转导后的活性。结果:hhO-1 cDNA与pET15b-PEP-1重组成功,重组质粒pET15b-PEP-1-hhO-1经酶切鉴定含有hhO-1 cDNA,测序分析证实与GenBank提供的原始序列完全一致;重组质粒转化后经诱导和纯化得到了融合蛋白PEP-1-hO-1,浓度达到1.0 g/L;融合蛋白可以穿透h9c2心肌细胞胞膜,进入细胞后主要分布在胞质和胞核内并具有天然活性。结论:成功地构建了pET15b-PEP-1-hhO-1原核表达质粒,获得了可穿透h9c2心肌细胞膜的血红素加氧酶-1融合蛋白PEP-1-hO-1,为应用hO-1治疗缺血性疾病的研究奠定了基础。

摘要：本研究旨在探索最优的小干扰RNA(small interference RNA, siRNA)及转染方法抑制微囊蛋白-3(caveolin-3,cAV3)的表达。方法 设计合成针对心肌h9c2细胞的cAV3 siRNA并转染,并与对照组比较cAV3蛋白表达量的改变。采用荧光倒置显微镜观测细胞转染效果,Western blot检测cAV3蛋白表达。结果 h9c2细胞转染cAV3siRNA后,荧光倒置显微镜下观察,与未转染相比,出现绿色荧光,Western blot结果显示细胞cAV3蛋白的表达量显著降低,达84.6%(P0.01)。结论 cAV3 siRNA转染显著抑制h9c2细胞中cAV3蛋白表达。

摘要：目的:胰岛素介导的葡萄糖摄取(insulin-mediated glucose uptake,IMGU)在骨骼肌和心肌细胞至关重要,但非胰岛素介导的葡萄糖摄取(non-insulin-mediated glucose uptake,NIMGU)也不容忽视。本文通过siRNA(small interference RNA, siRNA)下调微囊蛋白-3(caveolin-3, cAV3)蛋白表达,观察cAV3是否参与IMGU及NIMGU的生理过程。方法:分别设计合成针对骨骼肌c2c12细胞和心肌h9c2细胞的cAV3 siRNA并转染,c2c12细胞和h9c2细胞分别在有胰岛素和无胰岛素的DMEM培养基中培养,采用激光共聚焦显微镜观测细胞转染效果,Western blot检测cAV3、葡萄糖转运体4(Glucose transporter 4,GLUT4)蛋白表达,生化试剂盒检测细胞的葡萄糖摄取率。结果:转染cAV3 siRNA后成功下调c2c12和h9c2细胞cAV3蛋白的表达。在无胰岛素刺激时,c2c12细胞转染48 h后,GLUT4表达降低(P<0.01),葡萄糖摄取减少(P<0.05),h9c2细胞转染48 h后,GLUT4表达降低(P<0.05),葡萄糖摄取减少(P<0.01)。有胰岛素刺激时,c2c12细胞转染48 h后,GLUT4表达降低(P<0.01),葡萄糖摄取减少(P<0.01),h9c2细胞转染48 h后,GLUT4的下调无统计学意义,葡萄糖摄取减少(P<0.01)。结论:c2c12细胞和h9c2细胞存在IMGU和NIMGU的这两种不同状态。在胰岛素刺激的以及无胰岛素刺激的安静状态下,都通过cAV3调节GLUT4变化而影响细胞摄取葡萄糖。

摘要：本试验旨在研究短发夹RNA(shRNA)对大鼠心肌细胞牛磺酸转运体(TauT)的抑制作用。根据已克隆的大鼠心肌TauT基因序列设计并构建了3个shRNAs(shRNA1#、shRNA2#、shRNA3#)及1个阴性对照shRNA表达载体,利用脂质体LipofectamineTM2000将构建好的重组质粒shRNA1#、shRNA2#、shRNA3#及阴性对照质粒分别转染h9c2细胞,细胞分为对照组(未转染组)、shRNA-Neg组(阴性对照组)和3个转染组(shRNA1#组、shRNA2#组、shRNA3#组),每组3个重复。应用四唑盐(MTT)法检测h9c2细胞增殖情况,实时荧光定量PcR检测TauT mRNA表达水平。结果表明,与阴性对照组和未转染组比较,shRNA1#质粒仅在转染细胞后的24 h极显著降低了TauT mRNA表达水平(P0.05)。上述结果提示,shRNA2#重组质粒能有效抑制TauT基因的表达,且短期内未影响h9c2细胞增殖,为研究TauT基因及揭示牛磺酸在心肌细胞代谢中的作用奠定基础。

摘要：目的基于药用植物辽东楤木Aralia elata中的单体五环三萜皂苷类天然产物齐墩果酸-3-O-β-D-吡喃葡萄糖醛酸进行结构修饰,并对其结构修饰物进行体外心肌保护活性研究。方法分别以苷元齐墩果酸和熊果酸为起始原料,通过苄基保护、糖苷化、苄基脱保护、酰胺化、苯甲酰基脱保护共5步反应制得目标化合物,利用h9c2细胞评价该类衍生物的心肌保护活性。结果设计并合成10个辽东楤木单体化合物的结构衍生物F1~F10,均经波谱技术确证结构。药理结果表明,10个化合物对h9c2细胞呈现不同程度的心肌保护活性,其中化合物F3的心肌保护活性与先导物活性相当。结论化合物F1~F10均为未见文献报道的新化合物,具有潜在的心肌保护活性,值得深入研究。

摘要：目的:构建核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)p65亚基特异的核糖核酸干扰腺病毒表达载体,验证其对p65亚基的沉默效应。方法:设计针对大鼠NF-κB p65亚基的不同干扰序列,通过质粒将其导入腺病毒,感染大鼠心肌细胞(h9c2)。将感染后的心肌细胞通过RT-PcR方法和Western Blot方法检测各组NF-κB p65的基因水平表达和蛋白质水平表达。结果:成功构建了NF-κB p65亚基特异的RNAi腺病毒表达载体,获得高滴度的腺病毒液;RNAi腺病毒感染h9c2细胞后可以高效抑制NF-κB p65蛋白的表达。结论:RNAi技术能有效的沉默大鼠心肌细胞NF-κB p65的表达。