摘要：为了探究新城疫病毒(NDV)hn蛋白茎区居间序列氨基酸突变对其蛋白及病毒生物学特性的影响,利用overlapping PCR分别扩增包含E91A和S92A突变的hn基因,并将突变引入真核表达质粒pCAGGS及NDV全长cDNA中。通过红细胞吸附试验、神经氨酸酶试验等分析突变对蛋白功能的影响;并通过反向遗传操作技术拯救突变病毒,分析突变对病毒生物学特性的影响。结果显示,E91A突变能显著增强hn蛋白的红细胞吸附活性,同时显著降低神经氨酸酶活性;而S92A突变则导致蛋白的红细胞吸附活性及促融合功能显著下降;并且2个突变均会显著削弱病毒的复制能力,在一定程度上降低病毒毒力,影响其组织嗜性。研究结果表明,hn茎区居间序列的E91和S92氨基酸突变对蛋白及病毒的生物学特性具有重要影响,可作为减毒疫苗株改造及小分子药物设计的靶标位点。

摘要：鹅副粘病毒分离株NA_1经 11日龄鸡胚增殖后纯化。提取病毒的基因组RNA ,采用RT_PCR扩增出与预期设计的 1 7kb大小相符合的特异条带。将扩增产物提纯后克隆入pMD 18_T载体 ,经纯化、筛选及酶切鉴定后 ,初步获得了含鹅副粘病毒hn基因的阳性克隆 ,并对阳性克隆进行测序。测序后拼接得出hn基因的全序列长度为 174 0bp ,该基因的ORF总长为 1716bp ,编码 5 71个氨基酸。与GenBank下载的 15株参考毒株比较hn基因编码区全核苷酸序列 ,发现所测NA_1毒株与参考毒株YG97核苷酸序列同源性为 97 3% ,与F48E9同源性为 84 5 % ,与LaSota为 82 2 %。

摘要：用RT-PCR扩增新城疫病毒(NDV)hn基因,得到大小约1700bp的片段,将其克隆至pGEM-Teasy载体并测定其核苷酸序列。根据测序结果,另设计1对引物带有EcoR限制位点,用PCR扩增基因主要功能区即编码hn蛋白球状头部的hngd片段,将其分别克隆至pSOC和pR质粒soc基因3′端,重组质粒pSOC-hnGD转化***-21(DE3)感受态细胞,以终浓度1mmol/L的IPTG诱导表达,在SDS-PAGE凝胶上检测到相对分子质量大小约67000的目的蛋白条带。随后将重组质粒pR-hnGD转化T4宿主菌E2感受态细胞,阳性克隆用溶菌酶缺陷的T4-Z1感染,用不加溶菌酶的SC平板筛选阳性克隆。经PCR鉴定,hngd片段已整合在T4-Z1的基因组中。纯化后的重组噬菌体T4-Z1-hnGD用SDS-PAGE和Western-blot可检测到67000的特异条带。结果表明,hnGD蛋白成功展示在T4噬菌体衣壳表面,且与NDV抗血清具有良好的反应性。

摘要：参照新城疫病毒(NDV)hn基因序列,设计合成1对特异性引物,扩增长约870 bp的hn基因片段。将目的片段定向克隆至pET-30a原核表达载体,酶切及测序鉴定均正确后,转化BL21表达菌,经IPTG诱导得到了以包涵体形式表达的重组蛋白。重组蛋白纯化后,经免疫印迹及ELISA初步检测证明具有良好的抗原性和特异性。本研究利用原核表达系统成功表达具有良好抗原性的hn蛋白,为NDV的深入研究及诊断试剂的研制提供了物质基础。

摘要：用RT—PCR法从NDV Lasota疫苗株中扩增出hn基因，将其克隆到pGEM—T easy vector中，构建了重组质粒pT—hn．设计了1对引物，用PCR法扩增出hn蛋白主要抗原表位基因（442—1734bp共1239bp），将其连接到原核表达载体pET-28a（＋），构建重组质粒pET—hn．用IPTG诱导使其在大肠杆菌BL21（DE3）中表达．SDS—PAGE结果表明，NDV hn主要抗原表位基因在pET—hn中获得了高效融合表达，其表达蛋白的分子量为28kD．同时，通过试验摸索并确定了表达hn蛋白主要抗原表位基因的最佳诱导条件：IPTG终浓度为0．4mmol·L^-1，诱导时间为4h，温度为37℃．

摘要：目的在人食管癌ECA109细胞中表达新城疫病毒HBNU/LSRC/F3株hn基因,观察其编码蛋白的抗肿瘤特性。方法提取新城疫病毒总RNA,以根据hn基因开放阅读框(登录号为KC246549.1)和真核表达载体C-flag pcDNA3的多克隆位点设计的带酶切位点引物通过逆转录PCR(RT-PCR)扩增hn基因,然后连接到真核表达载体上,测序正确的重组质粒转染ECA109细胞,运用免疫荧光及RT-PCR检验hn基因的表达,通过流式细胞术检测其表达产物的抗肿瘤效果。结果 hn基因正确连接到真核表达载体C-flag pcDNA3上,测序显示hn基因序列与GenBank上已发表的HBNU/LSRC/F3株的hn序列一致。重组质粒转染ECA109细胞36h后,其胞质内可见黄绿色荧光,转染48h后扩增到hn基因,而空质粒转染细胞扩增阴性。经流式细胞术检测,重组质粒转化肿瘤细胞凋亡率为(8.2±1.56)%,空质粒对照组为(4.6±0.83)%,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 hn基因重组质粒转化ECA109细胞表达hn蛋白,该蛋白具有一定的抗肿瘤活性。

摘要：以上海某鸡场分离的1株对LoVo细胞及A549细胞具有良好的溶瘤效果且呈时间依赖性的新城疫病毒(Newcastle diseases virus,命名为SH15)为研究对象,依据Gen Bank中Mukteswar毒株,设计了10对引物以用于扩增SH15的片段cDNA,并对阳性克隆进行菌液PCR鉴定以及测序分析。测序分析比对结果确定,SH15株的全基因组长15 186 bp,在GenBank登录号为KY247177,结合生物学试验确定为中等毒力型。与其他毒株序列分析表明:该毒株与JS/9/05/Go、Mukteswar的全基因组同源性为99.8%,属于NDV的ClassⅡ分支中的基因Ⅲ型。推测SH15的溶瘤能力可能与hn蛋白中H203位点变异有关。本研究为了解新发现的溶瘤NDV毒株的生物学特性及全基因序列,以及以NDV为载体进一步开发肿瘤靶向药物奠定了基础。

摘要：目的克隆新城疫病毒HBNU/LSRC/F3株的血凝素神经氨酸酶蛋白(hn)基因,同时应用生物信息学工具分析其编码蛋白的主要特性。方法根据hn基因开放阅读框设计引物,提取新城疫病毒总RNA,通过逆转录PCR(RT-PCR)扩增hn基因,并将其连接到克隆载体上,利用蛋白分析专家系统(ExPASy)提供的ProtParam、Protscale、TMpred、Coil、MotifyScan、SWISS-MODEL等,NCBI上的CONSERVE DOMON、SMART、SignalP4.0、Bepipred 1.0、NetCTL等以及Bcepred、ABCpred、SOPMA、SYFPEITHI等生物信息学在线分析程序,结合PSORT II Prediction、rasmol等生物信息学软件,分析、预测其编码hn蛋白的主要特性及T/B细胞抗原表位等。结果 hn基因RT-PCR扩增产物与预期大小一致,并成功连接到克隆载体上,测序结果显示hn基因序列与GenBank上已发表的序列完全一致。其编码蛋白由571个氨基酸组成,分子式为C2766H4316N752O852S24,分子质量单位为62.5ku,等电点理论值为6.24。hn蛋白为跨膜蛋白,富含无规则卷曲(Cc)和α-螺旋(Hh),其主要定位在线粒体和胞质中。该蛋白共有12个亲水性较高区域(参数得分≥1.9),17个表面可及性较高区域(参数得分≥1.9),9个柔韧性较高区域(参数得分≥2.0),36个翻译后修饰位点,17个潜在的B细胞表位,12个CTL表位和辅助性T细胞的联合表位。结论成功克隆了hn基因并分析了其编码蛋白的主要特性,为后期hn蛋白的分子克隆及其抗肿瘤特性研究奠定了基础。

摘要：为建立一种快速的新城疫病毒(NDV)抗体检测方法,参照已发表的NDV基因组序列,设计合成1对特异性引物,PCR扩增了长约1044bp的hn基因片段。将目的片段定向克隆到pGEX-6p-1原核表达载体,酶切及测序鉴定均正确后,转化BL21表达菌,经IPTG诱导得到了以包涵体形式表达的重组蛋白。重组蛋白纯化后,经免疫印迹检测证明具有良好的抗原性和特异性。以该蛋白作为诊断抗原,建立了检测新城疫病毒抗体的间接ELISA诊断方法。该方法批内重复性试验的变异系数小于5%,批间重复性试验的变异系数小于10%;与血凝抑制试验(HI)相比较,符合率、敏感性和特异性分别为92.0%、91.0%和93.6%。