摘要：目的体外研究C-MYC反义寡核苷酸(ASODN)对人宫颈癌hela细胞凋亡的影响,寻求提高肿瘤细胞放射敏感性的方法。方法免疫组化、流式细胞术、半定量RT-PCR法鉴定ASODN的有效性;GIEMSA染色、流式细胞术检测凋亡指数(AI)、DNA LADDER检测细胞凋亡。结果转染后,免疫组化结果显示C-MYC蛋白表达降低;半定量RT-PCR结果显示C-MYC MRNA表达较空白对照组及阴性对照组明显减弱(P<0.05)。GIEMSA染色可见凋亡小体;流式细胞术结果显示转染后凋亡指数为(10.29±0.66)%,转染ASODN(C-MYC)联合放射的凋亡指数为(16.83±0.57)%,均明显高于空白对照组(1.79±0.19)%(P<0.05);DNA LADDER呈现具有凋亡特征的梯带。结论本实验所设计的ASODN能有效地抑制C-MYC基因的表达;转染ASODN(C-MYC)能够显著增加hela细胞凋亡,从而提高肿瘤细胞的放射敏感性。

摘要：背景:基因载体是基因治疗中重要的影响因素,阳离子脂质体细胞毒性低,转染效率高,是一种很有前景的基因转染载体。目的:评价两种阳离子脂质体介导基因转染宫颈癌细胞的转染效果,优化它们对宫颈癌细胞的转染条件。设计、时间及地点:以hela细胞为观察对象,分组设计。实验于2008-03/06在大连民族学院生命科学学院国家民委-教育部重点实验室完成。材料:质粒pGFP-N2购自Clontech公司,hela细胞由大连民族学院的实验室保存。方法:首先采用DNA延滞实验考察阳离子脂质体与DNA的结合能力,然后用进行细胞转染实验研究脂质体的转染效率,最后通过四甲基偶氮唑盐法考察脂质体对细胞的毒性。主要观察指标:采用DNA延滞实验观察阳离子脂质体Lipofectamine2000和DOTAP与DNA的结合能力,以报告基因(绿色荧光蛋白基因pGFP-N2),分析阳离子脂质体Lipofectamine2000和DOTAP转染hela细胞转染效率和细胞毒性。结果:Lipofectamine2000和DOTAP与DNA均有很强的结合力;以绿色荧光蛋白基因为报告基因,Lipofectamine2000转染率较高;当Lipofectamine2000与DNA质量比为3∶1时,转染效率最高,约72%,是DOTAP转染细胞最高活性的2.5倍;在最佳转染剂量时,2种试剂的细胞存活率均在75%以上,Lipofectamine2000的毒性相对较小。结论:对hela细胞而言,Lipofectamine2000较DOTAP具有更高的转染效率和较低的细胞毒性。

摘要：为寻找有效的乏氧细胞放射增敏剂,我们设计和合成出了七个新型化合物,其中五个是2,2’-（芳亚胺基）二乙基硫代硫酸钠的系列化合物,两个是苯丙氨酸类衍生物,并试验了它们对离体hela-S3细胞的放射增敏作用。在化学合成中,分别以前体物N,N-双（β氯乙基）取代苯胺与硫化硫酸钠反应。

摘要：目的:探讨RUNX2蛋白在宫颈鳞癌组织中的表达情况及RUNX2 siRNA对宫颈鳞癌hela229细胞RUNX2基因表达、细胞增殖及凋亡的影响。方法:应用免疫组化技术检测50例宫颈鳞癌、30例宫颈高级别鳞状上皮内病变(HSIL)及30例正常宫颈黏膜组织中RUNX2蛋白的表达情况,并分析宫颈鳞癌组织中RUNX2蛋白表达与临床病理特征的关系。设计合成RUNX2 siRNA,通过脂质体将其转染至hela229细胞,同时设立空白对照(不转染)和阴性对照(转染非特异性siRNA)细胞组。转染24、48、72 h后,采用MTT法检测各组细胞增殖,计算增殖抑制率;转染72 h后,采用RT-PCR及Western blot技术检测细胞中RUNX2 mRNA及蛋白的表达,采用流式细胞术检测细胞凋亡。结果:宫颈鳞癌组织中RUNX2阳性表达率高于HSIL及正常宫颈组织(P<0.001);宫颈鳞癌组织中RUNX2蛋白的表达与肿瘤的临床分期有关(P=0.004)。与空白对照组和阴性对照组比较,RUNX2 siRNA组hela229细胞增殖抑制率、RUNX2 mRNA及蛋白的表达均降低(P<0.05),细胞凋亡率升高(P<0.05)。结论:RUNX2基因的高表达与宫颈鳞癌细胞的增殖关系密切。

摘要：以HPV18 E6基因为靶位,研究siRNA对宫颈癌hela细胞生长的抑制作用。设计并合成siRNA,脂质体siNEO FX转染hela细胞,分别用MTT法,双层软琼脂克隆形成试验和流式细胞术分析了siRNA对hela细胞体外生长增殖活力、细胞周期分布的作用。siRNA作用后的hela细胞增殖速度减慢,软琼脂克隆形成率降低,G0/G1期细胞比率增加。HPV18 E6 siRNA能抑制hela细胞体外生长增殖能力并诱导细胞周期重新分布。

摘要：目的利用CRISPR/Cas9技术建立YAF2(YY1 associated factor 2)基因敲除的宫颈癌He La细胞株,用于YAF2基因在宫颈癌细胞中分子功能的研究。方法首先利用CRISPR/Cas9序列设计网站,设计两对靶向YAF2基因第2外显子不同位点的向导RNA(single-guide RNA,sgRNA)。化学合成sgRNA寡核苷酸序列,分别克隆至质粒p X335中,测序确认插入片段正确的克隆。先用一对重组载体转染He La细胞,7天后,再用另一对转染He La细胞,第2对转染3天后,取培养细胞的2/3提取基因组DNA,对敲除位点附近的片段进行PCR扩增后通过DNA测序对敲除效率进行分析,剩余细胞在96孔平板上通过有限稀释法筛选YAF2敲除的细胞株。用蛋白质免疫印迹实验初步鉴定YAF2蛋白质表达缺失的细胞克隆,提取其基因组DNA,对敲除位点附近的序列进行PCR扩增,将扩增产物克隆至p GEM-T easy载体,通过DNA测序确认YAF2基因纯合敲除的细胞株。结果成功构建两对针对人YAF2基因第二外显子的p X335-sgRNA质粒;PCR产物测序证明两对重组载体均有YAF2基因敲除活性;得到2株YAF2敲除的He La细胞株。结论利用CRISPR/Cas9技术在He La细胞中成功敲除YAF2基因,为在He La细胞中研究YAF2的分子功能奠定基础。

摘要：[目的]通过CRISPR/Cas9技术构建线粒体抗病毒信号(mitochondrial antiviral signaling, MAVS)基因敲除的hela细胞系,并对细胞系的生长特性、及其对干扰素信号通路的影响进行初步鉴定。[方法]针对MAVS外显子设计构建靶向MAVS基因的guide RNA,并克隆至LentiCRISPR v2载体后包装成慢病毒,感染hela细胞后经嘌呤霉素筛选获得MAVS基因敲除的hela细胞,Western Blotting验证敲除效果,MTT法检测细胞生长活力,应用聚肌胞苷酸(Poly(I:C))刺激并检测细胞内干扰素-β(IFN-β)mRNA水平的变化。[结果]测序结果表明成功构建CRISPR-MAVS-gR质粒,包装成慢病毒并感染hela细胞,经筛选获得的细胞内MAVS mRNA及蛋白均不表达,生长速度及活性与野生型hela相同,Poly(I:C)刺激后,细胞内IFN-β变化不明显。[结论]通过CRISPR/Cas9技术获得MAVS基因敲除的MAVS^(-/-)hela细胞系,Poly(I:C)诱导剂不能在该细胞内激活干扰素信号通路,为后续研究MAVS相关的抗病毒天然免疫信号通路奠定了基础。

摘要：目的 :体外研究bcl- 2反义寡核苷酸对人宫颈癌hela细胞凋亡的影响 ,旨在寻求提高肿瘤细胞放射敏感性的方法。方法 :(1)免疫组化、半定量RT -PCR法鉴定ASODN的有效性。 (2 )Giemsa染色、流式细胞术凋亡指数 (AI)、DNALadder检测细胞凋亡。结果 :(1)转染后 ,免疫组化结果示Bcl- 2蛋白表达降低 ;半定量RT -PCR结果显示bcl- 2mRNA表达较对照组明显减弱 (P <0 0 5 )。 (2 )转染后 ,Giemsa染色可见凋亡小体 ;流式细胞术结果显示转染后AI为 :6 6 0± 0 70 % ,明显高于对照组 1 79± 0 19% (P <0 0 5 ) ;DNALadder呈现具有凋亡特征的梯带。结论 :(1)本实验所设计的ASODN能有效地抑制bcl- 2基因的表达。 (2 )转染ASODN (bcl-2 )能够显著增加hela细胞凋亡。进而有望通过转染ASODN提高肿瘤细胞的放射敏感性。

摘要：目的:针对BMI-1基因的不同部位构建4种不同的BMI-1 shRNA真核表达载体,转染人宫颈癌细胞系hela并筛选其有效序列。方法:应用DNA重组技术将针对人BMI-1基因的不同部位所设计的4对shRNA序列克隆到真核表达质粒psi RNA-hH1neo中,构建BMI-1 shRNA表达载体BMI-1 shRNA1、BMI-1 shRNA2、BMI-1 shRNA3和BMI-1 shRNA4,用阳离子脂质体介导转染hela细胞以筛选其有效序列。结果:4个BMI-1 shRNA表达载体BMI-1 shRNA1、BMI-1 shRNA2、BM-1 shRNA3和BMI-1shRNA4经测序鉴定证明插入正确。②在hela细胞中转染BMI-1 shRNA2和BMI-1 shRNA4能显著下调BMI-1mRNA表达,抑制率分别为59.9%和67.4%(P<0.01)。结论:成功构建了真核表达载体BMI-1 shRNA1、BMI-1 shRNA2、BMI-1 shRNA3和BMI-1 shRNA4,其中BMI-1 shRNA2和BMI-1 shRNA4能有效地抑制BMI-1在hela细胞中的表达。本工作为今后研究BMI-1在肿瘤基因治疗中奠定基础。

摘要：目的观察mi R-145对宫颈癌hela细胞C-myc表达的影响,探讨mi R-145对C-myc的调控作用。方法以RT-PCR检测法检测hela细胞中mi R-145和C-myc m RNA的表达。运用West Blot检测法检测C-myc蛋白的表达情况;设计并合成mi R-145的模拟物和mi R-145的抑制剂,以及两者的空白对照序列(模拟对照,抑制剂对照),用脂质体Liposome2000分别包裹二者后以使其转染,同时设立空转Liposome2000用作对照。转染后24 h分别检测C-myc m RNA和蛋白的表达变化。实验数据采用单因素方差分析和t检验进行统计分析。结果hela细胞中mi R-145和C-myc的表达呈阳性。转染24 h后,模拟组,模拟对照组,抑制剂组,抑制剂对照组及脂质体组中C-myc m RNA相对表达水平分别为(0.40±0.32)、(0.59±0.18)、(1. 22±0.38)、(0.73±0.25)和(0.48±0.15);蛋白相对表达水平分别为(0.30±0.17)、(0.50±0.17)、(1. 35±0.59)、(0.71±0.14)和(0.72±0.29);模拟组C-myc的m RNA和蛋白相对表达水平显着低于模拟对照组和脂质体组(P<0.05)。而C-myc的m RNA和蛋白在抑制剂组中的相对表达水平显着高于抑制剂对照组和脂质体组(P <0.05)。结论人宫颈癌hela细胞株中, C-myc是mi R-145的靶基因, mi R-145通过下调C-myc m RNA及其蛋白的表达水平,发挥负向调控C-myc的作用。